碱性蛋白酶酶解荷叶蛋白制备多肽的工艺

李伟民，周海燕，郑丽娟，余小娜，魏泉增

1. 许昌学院食品与生物工程学院，河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室（许昌 461000）；2. 鄢陵县市场监督管理局（许昌 461200）

荷叶是一种有根茎的水生植物，属睡莲科。荷叶在中国许多地区均有种植，如浙江、江苏、湖南等地[1]。荷叶资源的利用主要针对荷叶中含有大量的维生素C和原荷叶碱、荷叶碱等多种生物碱[2]。这些物质可用于治疗燥热渴闷、暑湿泄泻、便血崩漏[3]等症状，还具有保肝护肝[4]、消炎[5]等功效。荷叶中同时还含有丰富的蛋白质[6]，为更好地利用荷叶蛋白资源，酶解制备多肽工艺十分必要。

蛋白经过蛋白酶酶解后，得到的多肽与相应的蛋白相比，更加容易通过小肠黏膜被机体吸收[7]，从而具有更高的营养价值[8]。多肽由2～16个氨基酸组成[9]，具有多种生物活性，如抑菌性[10]、免疫性[11]、和抗氧化性[12]等方面。

大多数制备多肽的工艺都是以大豆、大米等粮食作物为原料。随着全球人口数量日益增多，对食物的需求量也逐渐增大，大米、玉米、小麦等主要粮食作物的进口量都在成倍增长[13]。对新型蛋白质资源的开发利用具有广阔前景。荷叶干粉中的蛋白质含量达22.9%[14]，对荷叶蛋白资源的进一步开发利用，具有重要的研究意义。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

荷叶粉；碱性蛋白酶（酶活力20万 U/g，天津市诺奥科技发展有限公司）；其他试剂（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

FA2014B分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；TDL-60B离心机（上海安亭科学仪器厂）；T6可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Dk-8D水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；PHS-3C型pH计（上海佑科仪器仪表有限公司）；DL-1型电炉（中兴伟业仪器有限公司）；750t型粉碎机（鹤壁市天冠仪器仪表有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解工艺

准确称取一定量的荷叶粉与反应容器中，依照蛋白酶添加量加入碱性蛋白酶溶液，调整到预设pH，缓慢搅拌，酶解过程中注意维持酶解系统pH恒定。酶解结束后将酶液迅速置于沸水中灭酶10 min。冷却至室温后以4 000 r/min离心10 min，收集上清液。

1.3.2 标准曲线的绘制

多肽含量测定方法采用双缩脲法[15]。准确称量1.000 g酪蛋白，用30 mL 10% NaOH溶液溶解，溶解后，用蒸馏水定容至100 mL，得到10 mg/mL酪蛋白标准溶液。分别在6支试管中加入0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL酪蛋白标准液，用蒸馏水补齐至1.0 mL，分别加入4 mL双缩脲试剂于6支试管中，充分混合均匀，在室温下反应30 min，在540 nm处比色测定。

1.3.3 多肽浓度测定

将收集到的上清液定容至100 mL，摇匀移取溶液10 mL至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，使上清液澄清，吸取上清液1 mL，并和4 mL双缩脲试剂混合，以蒸馏水为空白，室温下溶液反应30 min，测定吸光度。根据标准曲线关系式，计算溶液浓度。

1.3.4 单因素试验

确定碱性蛋白酶添加量（1 000，1 500，2 000，2 500和3 000 U/g），酶解温度（40，45，50，55和60 ℃），酶解时间（2，3，4，5和6 h），酶解pH（7.0，8.0，9.0，10.0和11.0）4个因素，分别对溶液中多肽含量的影响。

1.3.5 响应面试验

在单因素试验结果探索最适酶解时间、最适酶解pH、最适酶解温度、最适碱性蛋白添加量的基础上，选取其中的酶解时间、酶解pH、酶解温度作响应面综合分析。采用Design-Expert 8.0.6软件中心组合试验进行多肽含量提取最佳工艺。试验方案见表1。

表1 试验因素和水平

2 结果与分析

2.1 酪蛋白标准曲线

以酪蛋白含量为横坐标，吸光度作为纵坐标，酪蛋白标准曲线如图1所示。回归方程为：y=0.043 5x+0.000 9，R2=0.999 9。

图1 蛋白标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 碱性蛋白酶添加量对酶解效果的影响

碱性蛋白酶添加量对酶解液中多肽含量的影响如图2所示。随着蛋白酶添加量的增加，溶液中多肽含量呈现先增加后下降的趋势。酶添加量1 000 U/g的条件下多肽含量最低，随着蛋白酶添加量增加，水解度不断增大。碱性蛋白酶添加量2 000 U/g时，多肽含量最高，随着蛋白酶量继续增加，多肽含量降低。当酶浓度过高时，酶分子间可能相互水解，导致酶解效果下降[16]。也可能由于蛋白质的过度水解破坏了肽键，产生氨基酸，使多肽的含量减少。

2.2.2 酶解时间对酶解液中多肽含量的影响

酶解时间对酶解效果的影响如图3所示。荷叶多肽的含量呈现出先上升后下降趋势，酶解2 h条件下多肽含量最低，随着时间的增加，荷叶多肽含量随之增加。荷叶在酶解时间5 h时多肽含量最大。随着酶解时间继续增加，荷叶多肽含量下降，酶解时间6 h时，酶解液中多肽含量最低，这可能是由于随着酶解时间的延长，酶浓度逐渐减小，活性逐渐下降，最终失活。酶解最适时间为5 h。

图2 碱性蛋白酶添加量对荷叶多肽含量的影响

图3 酶解时间对荷叶多肽含量的影响

2.2.3 温度对酶解液中多肽含量的影响

温度对酶解液中多肽含量的影响如图4所示。温度从40 ℃升至60 ℃过程中，荷叶多肽得率呈现出先上升后下降趋势。在40 ℃条件下荷叶多肽的含量最低，温度升至55 ℃时荷叶多肽的得率达到最大值。继续升高温度，多肽含量反而下降。温度偏高或偏低会抑制碱性蛋白酶的活性，温度过高会导致碱性蛋白酶逐渐失活，影响酶解效果，碱性蛋白酶酶解荷叶蛋白的最适温度在55 ℃。

图4 酶解温度对荷叶多肽含量的影响

2.2.4 酶解pH对酶解液中多肽含量的影响

酶解pH对酶解液中多肽含量的影响如图5所示。在pH 7.0～11.0过程中，荷叶多肽的得率呈现出先增加后减小趋势。pH 7.0时荷叶多肽的含量最低。pH 9.0时，荷叶多肽的得率达到最大值。随着pH继续增大，由于环境条件的pH超过酶的最适pH，限制酶的活性，所以酶解液中的多肽含量也随之下降。碱性蛋白酶酶解荷叶蛋白的最适pH为9.0。

图5 酶解pH对荷叶多肽含量的影响

2.3 响应面法优化

2.3.1 响应面法试验分析及结果

从4个单因素结果中选取酶解时间（A）、酶解pH（B）、酶解温度（C）这3个因素作为参考依据，以多肽含量为指标。进行响应面试验，确定碱性蛋白酶水解制备荷叶多肽的最佳工艺条件。响应面试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.3.2 方差分析

通过Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析，建立多元二次响应面回归模型为：R=13.15-0.069A-0.13B-0.015C-0.046AB+0.031AC-0.061BC-0.29A2-0.29B2-0.27C2。由表3可以看出模型达到极显著（p＜0.01），失拟项不显著（p＞0.05），表明方程无失拟性因素存在，回归模型与实际值能较好的拟合。一次项A、B表现为极显著，二次项A2、B2、C2表现为极显著，说明他们对响应值影响极大。由F检验可以得到影响因素主次排序为：酶解pH（B）、酶解时间（A）和酶解温度（C）。

表3 回归分析结果

图6直观反映不同两因素之间的交互作用对多肽含量的影响，曲面越弯曲，两因素交互作用对多肽含量的影响越显著[17]。由表4可知，其中因素BC对酶解效果影响极显著（p＜0.01），AB对酶解效果影响显著（p＜0.05），AC对多肽含量的影响不显著（p＞0.05）。

图6 不同两因素之间交互作用对酶解液中多肽含量的影响

2.4 荷叶蛋白酶解工艺的确定及优化工艺条件验证

经Box-Behnken试验设计，Design-Expert 8.0.6软件分析得出最优条件为：酶解pH 8.78，酶解时间4.9 h，酶解温度54.9 ℃。此条件下酶解液中多肽含量为13.164 8 mg/mL。将工艺参数调整为：酶解时间4.9 h，酶解温度54.9 ℃，酶解pH 8.78。在此工艺测定的多肽含量为13.158 6 mg/mL。与理论条件下的多肽含量较为接近。试验可以证明模型可靠，方程能够比较真实地反映各因素对多肽含量影响的实际情况。通过软件建造的模型也能真实直观地反映情况，模型与实际情况贴近吻合，响应面的数据处理真实有效。

3 结论

荷叶中蛋白质的含量较高，并且荷叶价格低廉。通过酶解的方法制备荷叶多肽，条件温和，无化学试剂残留，对人体无害。试验探讨了在单因素基础上，进行响应面试验对荷叶蛋白酶解工艺进行优化，荷叶多肽制备的最优条件为：加酶量2 000 U/g，酶解pH 8.78，酶解温度54.9 ℃，酶解时间4.9 h。在此条件下，测得溶液中多肽的含量最高，与预测值两者之间相对误差为0.05%。为利用中国荷叶蛋白资源，提高荷叶附加值提供基础。