黑老虎果皮和种子的抗氧化、抑菌和抑酶活性

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（1.湖南省芷江侗族自治县质量监督检验及计量检定所，湖南 芷江 419100；2.中南林业科技大学a.食品科学与工程学院；b.林产可食资源安全与加工利用湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；3.湖南省通道南楚农业开发有限公司，湖南 通道 418599）

黑老虎Kadsura coccinea是木兰科五味子属常绿藤本植物，别名冷饭团，苗语称“布福娜”等，主要分布于我国的湖南、贵州、四川、江西等地[1]。黑老虎的根和藤具有抗肿瘤、抗氧化等活性，还具有清热解毒、袪风活络、调气止痛、补血养颜等功效，是苗、侗等少数民族千百年来沿用至今的一种珍贵药材[2]。黑老虎果实富含多种人体所需微量元素[3]，及多酚和维生素C 等活性成分[4]。果实成熟后，味道清甜可口，是一种营养丰富的药食两用水果，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、保肝、养颜美白等作用[5]，侗族少女有将黑老虎果汁敷面的传统，韩国最大的护肤品企业爱茉莉集团的产品中也有应用[6]。

黑老虎主要为鲜食野生水果，果肉可食部位仅40%～60%。在黑老虎果实的食用和生产加工过程中，其果皮和种子大多会被废弃。现阶段对黑老虎的研究主要集中在栽培、繁育[7]及根中化学成分[8]等方面，关于其果实皮和籽等副产物的生物活性的研究鲜有报道。

本研究中以2 种常见的黑老虎品种为原料，用乙醇提取黑老虎果皮、种子中的活性物质，测定其抗氧化和抑菌活性及其对酪氨酸酶、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性，评价其生物活性，旨在为黑老虎果皮和种子的加工利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

黑老虎果实采自湖南通道，包括大红和紫黑2个品种。

试剂包括：DPPH（日本TIC 科技有限公司），ABTS（合肥博美生物有限公司），α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶（Worthington 化学公司），PNPG（上海斯信生物科技有限公司），阿卡波糖（拜耳医药保健有限公司）。

鼠伤寒沙门氏菌、枯草杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均来自中南林业科技大学微生物教研室。

1.2 仪器与设备

UV1800 紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），Rotavator R-3 旋转蒸发器（天津市泰斯特仪器有限公司），L420 多功能酶标仪（美国PerkinElmer 公司），FORMA311 恒温箱（美国Thermo 公司），JP-150A-8 高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 活性物质的提取

手工分离果皮和种子，用清水冲洗干净粘附的果肉，晾干，置于45 ℃烘箱中干燥36 h 后，粉碎成粉末状（过60 目筛）。称取10 g 果皮（种子）粉末，加入50 mL 70%的乙醇，在室温下浸提4 h后过滤，用等量的乙醇再次浸提1 次滤渣。合并2次的滤液，在40 ℃下真空减压浓缩至20 mL，得到相当于含生药500 g/L 的乙醇提取液，-20 ℃下保存，待用。

1.3.2 提取液活性成分含量的测定

参考Bursal 等[9]的方法测定提取液的多酚含量。取1 mL 提取液，依次加入22 mL 去离子水、500 µL 福林试剂和300 µL 10%的碳酸钠溶液，室温下反应30 min 后，于760 nm 波长下测吸光度，取3 次重复的平均值作为试验结果。多酚含量以每克干样品中没食子酸当量来计算（mg/g）。

参考Zielinski 等[10]的方法测定提取液的黄酮含量。取250 µL 提取液，加入2 720 µL 30%的乙醇溶液和120 µL 的亚硝酸钠溶液（0.5 mol/L），振荡30 s 后，静止反应5 min，再加入120 µL 10%的氯化铝溶液反应5 min，最后加入800 μL 氢氧化钠溶液（1 mol/L），于510 nm 波长下测吸光度，取3 次重复的平均值作为试验结果。黄酮含量以每克干样品中儿茶素当量计算（mg/g）。

1.3.3 提取液生物活性的测定

1.3.3.1 抗氧化活性的测定

采用3 种方法进行抗氧化活性的测定[11]，每组试验均进行3 次平行试验，取其平均值作为试验结果。抗氧化能力以每克干样品中Trolox 当量（µmoL/g）计算。

DPPH·清除活性的测定方法：取300 μL 提取液，加入1.9 mL 的DPPH 溶液（0.094 mmol/L）混合均匀后，置于室温下反应30 min，以80%的甲醇调零，并于517 nm 波长下测定吸光度。

ABTS+·清除活性测定方法：取1 mL 提取液和4 mL ABTS+·混合溶液，摇匀，以无水乙醇作为空白，于734 nm 波长下测定吸光度。

铁离子还原力（FRAP）测定方法：取900 μL提取液，加入2.7 mL 的FRAP 溶液和270 μL 超纯水，振荡均匀，置于37 ℃的水浴锅中30 min。以80%的甲醇溶液作为空白，于595 nm 波长下测定吸光度。

1.3.3.2 抑菌活性的测定

试验用菌种包括鼠伤寒沙门氏菌、枯草杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。采用打孔法[12]测定提取液的抑菌活性。每孔加入30 μL 不同浓度的样品，以等量的无菌蒸馏水为阴性对照，以等量的0.3 mg/L 青霉素为阳性对照，在35 ℃的温度条件下培养24 h。重复试验3 次，取其平均值。采用刃天青法[13]测定提取液的最小抑菌浓度，取无菌96 孔板，向所需各孔中加入80 µL 液体培养基，第1排孔加80 µL 样品（500 g/L）；用逐步梯度法稀释样品浓度，分别用无菌水和0.3 mg/L青霉素作为阴性对照和阳性对照。每孔加入10 µL 细菌稀释液（5×106CFU/mL），混匀后，于37 ℃条件下恒温培养20 h，再分别加入10 µL 刃天青，放置2 h 后观察试验结果。粉红色表示有细菌生长，蓝色表示无细菌生长，以抑制细菌生长样品的最小浓度作为最小抑菌浓度。

1.3.3.3 抑酶活性的测定

1）酪氨酸酶活性抑制率的测定。参考王雅等[14]的方法进行酪氨酶活性的测定。空白组准确量取30 µL去离子水和80 µL磷酸缓冲溶液于96孔板中，在37 ℃的恒温水浴中保存10 min；再加入50 μL比活力为835 U/mg的酪氨酸酶溶液，反应5 min后，用酶标仪于492 nm 波长下迅速测定吸光度（A1）。酪氨酸对照组以50 µL 的L-酪氨酸溶液和30 µL的磷酸缓冲溶液代替空白组的磷酸缓冲液，测定吸光度（A2）；样品对照组以30 µL 的样品溶液代替空白组的去离子水，测定吸光度（A3）；试验组以30 µL 的样品溶液代替酪氨酸对照组的去离子水，测定吸光度（A4）。每组以4 个重复孔为平行，计算黑老虎不同部位提取液对酪氨酸酶活性的抑制率（R1），并且以维生素C 溶液（10 g/L）作为对照。

R1＝[1-(A4-A3)/(A2-A1)]×100%。

2）α-葡萄糖苷酶活性抑制率的测定。参考李项辉[15]的方法，并适当修改，进行α-葡萄糖苷酶活性的测定。取30 μL 黑老虎提取液置于96孔板孔中，试验组加入50 μL 的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mg） 和50 μL 的PNPG（24 mmol/L），37 ℃条件下反应30 min，加100 μL 的Na2CO3溶液（0.1 mol/L），37 ℃条件下反应10 min，用酶标仪于405 nm波长下测定吸光值（A1）。空白组（A2）以50 μL 磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L）代替50 μL的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mg）。样品对照组（A3）以30 μL 磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L）代替30 μL 的样品。溶剂对照组（A4）以80 μL 磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L）代替30 μL 的样品和50 μL 的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mg）。以阿卡波糖作为阳性对照，通过下式计算黑老虎不同部位提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率（R2）。

R2＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%。

3）α-淀粉酶活性抑制率的测定。参考叶琼仙等[16]的方法进行α-淀粉酶抑制活性的测定。取200 μL 样品溶液与200 μL 的α-淀粉酶溶液混合，在37 ℃下孵育10 min 后加入400 μL 0.25%的淀粉溶液，置于37 ℃水浴中反应10 min 后加入1.0 mL DNS 显色剂，置于沸水中加热10 min 后冷却至室温。加入10 mL 蒸馏水稀释后，于540 nm波长下测定吸光度（A1），以200 μL 20 mmol/L pH6.9 的磷酸钠缓冲液代替200 μL 的α-淀粉酶溶液作为背景对照（A2），以200 μL 20 mmol/L pH6.9 的磷酸钠缓冲液代替200 μL 样品溶液作为阴性对照（A3）。通过下式计算黑老虎不同部位提取液对α-淀粉酶活性的抑制率（R3）。

R3＝[1-(A1-A2)/A3]×100%。

以酶活性抑制率为50%时样品的浓度为半数抑制浓度（IC50）。使用GraphPad Prism7.0 软件计算IC50。

2 结果与分析

2.1 黑老虎果皮和种子提取液的多酚和黄酮含量

黑老虎果皮和种子提取液中多酚和黄酮含量如图1所示。由图1可见，黑老虎果皮和种子提取液的多酚含量为0.21 ～0.95 mg/g，4 种样品提取液的多酚含量存在显著性差异（P＜0.05），按其含量由高到低依次为大红果皮、紫黑果皮、紫黑种子、大红种子，2 个品种黑老虎果皮的多酚含量均高于种子。黑老虎果皮和种子提取液的黄酮含量为0.66 ～1.61 mg/g，换算成鲜果皮和种子的黄酮含量为0.09 ～0.22 mg/g，低于贵州黑老虎鲜果皮和种子的黄酮含量（1.21 ～12.69 mg/g），接近湖南黑老虎鲜果皮和种子的黄酮含量（0.98 ～4.22 mg/g）[17]。其中，紫黑果皮的黄酮含量最高，紫黑种子的含量最低。与多酚含量相似，2 个品种黑老虎果皮的黄酮含量高于种子。黑老虎果皮的多酚和黄酮含量均高于种子，其他产地的黑老虎也存在这种差异[17]，可能与黑老虎的品种、部位以及果实成熟度等因素有一定关系。

2.2 黑老虎果皮和种子提取液的生物活性

2.2.1 抗氧化活性

使用3 种方法测得的黑老虎果皮和种子提取液的抗氧化活性见表1。由表1可知，提取液的DPPH·清除活性为0.35 ～0.40 μmol/g，各样品中以大红果皮的DPPH·清除活性最高。ABTS+·清除活性为0.16 ～0.29 μmol/g，4 种样品中大红果皮的活性最高。铁离子还原力也是以大红果皮提取液最高。此外，4 种样品中除紫黑果皮的DPPH·清除活性外，其他均呈现出果皮抗氧化活性大于种子的趋势。这可能是因为果皮较种子的多酚和黄酮含量高[18]。

图1 黑老虎果皮和种子提取液中多酚和黄酮的含量Fig.1 The contents of polyphenols and flavonoids in extracts of peel and seed from K.coccinea

表1 黑老虎果皮和种子提取液的抗氧化活性†Table1 Antioxidant activity of peel and seed extracts from K.coccinea µmol/g

2.2.2 抑菌活性

抑菌试验结果表明，黑老虎果皮和种子提取液对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌3 种细菌未显示抑菌效果，对鼠伤寒沙门氏菌和枯草杆菌有一定的抑制作用，结果见表2。由表2可知，黑老虎果皮和种子提取液在试验浓度下对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径为7.22 ～11.90 mm。其中，大红果皮提取液的抑菌圈直径最大，为(11.90±0.04) mm，大红种子提取液的抑菌圈直径最小，紫黑果皮和种子的抑菌圈直径无显著性差异。4 种样品提取液对枯草杆菌的抑菌圈直径为7.30 ～13.40 mm，紫黑果皮提取液抑菌圈直径最大，为(13.40±0.05) mm，紫黑种子提取液的抑菌圈直径最小。黑老虎果皮提取液对鼠伤寒沙门氏菌和枯草杆菌的抑菌效果均优于种子，这可能是因为果皮中多酚和黄酮含量均高于种子。

最小抑菌浓度试验结果（表2）也表明，果皮提取液的抑菌活性显著优于种子，大红不同部位提取液的抑菌活性强于紫黑。由表2可知，在对鼠伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度试验中，大红果皮的抑菌效果最好，其最小抑菌质量浓度最小，为31.25 g/L，显著优于紫黑果皮和紫黑种子提取液的抑菌活性，后两者的最小抑菌质量浓度均为62.5 g/L，也显著高于大红种子的抑菌活性，后者的最小抑菌质量浓度为125 g/L。在对枯草杆菌的最小抑菌浓度试验中，2 个黑老虎品种均为果皮的抑菌效果优于种子，果皮的最小抑菌质量浓度均为31.25 g/L，种子的最小抑菌质量浓度均为62.50 g/L。黑老虎大红种子提取液对枯草杆菌的抑菌效果与紫黑种子相当，但对沙门氏菌的抑菌效果远不如紫黑种子。

2.2.3 抑酶活性

2.2.3.1 对酪氨酸酶活性的抑制率

黑老虎果皮和种子提取液对酪氨酸酶的抑制活性如图2所示。由图2可见，在一定的浓度范围内，随着果皮和种子提取液浓度的增大，其对酪氨酸酶的抑制率均呈上升趋势，当提取液质量浓度为67.5 g/L 时，对酪氨酸酶的抑制率为23.51%～45.13%，当质量浓度达到500 g/L 时，种子提取液的抑制率仅为55.43%～60.43%，而果皮提取液的抑制率可达到90%以上，低于对照组维生素C 溶液对酪氨酸酶活性的抑制率，维生素C溶液质量浓度为10 g/L 时，抑制率为96.81%。IC50计算结果表明，大红果皮提取液IC50为117.23 g/L，紫黑果皮为90.27 g/L，大红种子为248.57 g/L，紫黑种子为310.64 g/L。因此，黑老虎果皮和种子提取液对酪氨酸酶的抑制活性由大到小依次为紫黑果皮、大红果皮、大红种子、紫黑种子。

表2 黑老虎果皮和种子提取液的抑菌活性Table2 The bacteria inhibition activities of peel and seed extracts from K.coccinea

图2 黑老虎果皮和种子提取液对酪氨酸酶活性的抑制率Fig.2 The tyrosinase inhibition rate of peel and seed extracts from K.coccinea

2.2.3.2 对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制率

由黑老虎果皮和种子提取液对α-葡萄糖苷酶（图3）和α-淀粉酶的抑制活性（图4）可以看出，4 种提取液对2 种酶的抑制效果均呈剂量浓度效应。当提取液质量浓度在125 g/L 时，抑制效果较弱，抑制率仅为3.43%～13.56%。随着质量浓度提升至250 g/L，提取液对2 种酶的抑制率明显提高，尤其是大红果皮提取液展现了最好的抑制活性，在此质量浓度下，对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到了(43.47±1.37)%，对α-淀粉酶的抑制率达到了(49.73±0.99)%。当质量浓度达到500 g/L时，4 种提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为31.18%～62.96%，仍以大红果皮提取液的抑制活性为最高，大红果皮提取液对α-淀粉酶的抑制效果也最好，达到了(71.68±1.25)%。

图3 黑老虎果皮和种子提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.3 The α-glucosamine inhibitory rate of peel and seed extracts from K.coccinea

相同品种的黑老虎均是果皮提取液对2 种酶的抑制率大于种子，这可能是因为果皮中含有较多的多酚类物质所致。但整体活性弱于阳性对照阿卡波糖，质量浓度为5 g/L 的阿卡波糖对0.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶的抑制率为(85.14±2.29)%；质量浓度为2 g/L 的阿卡波糖对0.5 U/mL 的α-淀粉酶的抑制率为(89.87±2.36)%。阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率明显高于对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

图4 黑老虎果皮和种子提取液对α-淀粉酶活性的抑制率Fig.4 The α-amylase inhibition rate of peel and seed extracts from K.coccinea

3 结论与讨论

本试验中对湖南通道黑老虎果皮和种子提取液的生物活性进行了测定，结果表明2 个黑老虎品种（紫黑和大红）的果皮和种子提取液对鼠伤寒沙门氏菌和枯草杆菌有较好的抑菌活性，有较高的酪氨酸酶抑制活性，同时显示了较好的抗氧化活性及对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果，且果皮提取液的生物活性优于种子提取液。其中，大红果皮提取液对鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果最佳，紫黑果皮对枯草杆菌和酪氨酸酶的抑制效果最佳。黑老虎作为我国少数民族的传统中药材，具有较高的药用价值，但其果实目前主要作为鲜果食用，尚未得到充分利用，会产生大量的皮籽等副产物，该研究结果可为黑老虎果皮种子的综合开发利用提供参考，尤其是其果皮提取液具有抑制酪氨酸酶的功效，可作为美容产品活性成分的来源。

保健和皮肤美白已成为广大民众关注的热点。大量研究结果表明，人体很多疾病的发生与体内活性氧自由基的增多有较大关系。血清中脂质自由基的分解产物醛可与蛋白质、核酸等物质中的氨基反应，并使蛋白质变性和酶失活，进而被吞噬细胞吞噬，但这些变性物质未能被完全消化，在细胞内累积，使皮肤色素沉积。同时，色素的生成与酪氨酸酶有紧密关系，酪氨酸酶是生物体内黑色素生成的关键酶，酪氨酸酶抑制剂被广泛应用于美白化妆品领域，在医药方面用于预防和治疗黑色素瘤、黄褐斑等色素沉积性疾病。多酚类物质能有效地清除自由基，酚类化合物通过羟基基团提供氢质子，使具有高度氧化性的自由基还原，进而发挥清除自由基的目的，或通过抑制或阻断氧化反应的启动/传播链，将自由基转化为危害性较小的分子，修复人体细胞的氧化损伤[19]。同时，一些多酚类化合物具有较好的抑制酪氨酸酶活性，如从紫花苜蓿鲜花瓣中分离得到山奈酚对蘑菇酪氨酸酶的50%酶抑制浓度（IC50）为67 mg/L[20]。筛选具有较高抗氧化活性成分的天然产物已成为研究热点[21-22]。本试验结果表明，果皮提取液对酪氨酸酶的抑制率明显优于种子，这可能与不同品种的果皮和种子中黄酮含量不同有关，这与榉树叶对酪氨酸酶抑制率的变化趋势一致[23]，其抑制酪氨酸酶的具体化合物成分有待进一步研究。

本试验中，黑老虎提取液展示了较好的清除自由基活性、抑制酪氨酸酶活性和抑菌活性，且果皮提取液的生物活性强于种子提取液，可能与其所含的活性成分，尤其是多酚类化合物，有较大关系。多酚可以破坏细菌的细胞膜结构而增加细胞通透性，或多酚结构中的酚羟基易与蛋白质分子多点结合，使酶的活性降低，减缓细菌能量代谢速度，达到预防并阻止微生物侵染的目的，因而具有抗菌活性[24]。刘丽[25]对五味子属南五味子的研究结果表明果皮的抑菌效果一般优于种子，与本试验结果一致。南五味子醇提物对金黄色葡萄球菌也显示出较好的抑菌活性[26]。有研究结果表明，黑老虎果皮中含有矢车菊素-3-木糖基-芸香糖苷、飞燕草素-3-木糖基-芸香糖苷、矢车菊素-3-葡糖基-芸香糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷等花青素[27]，这些活性成分主要通过抑制活性氧（ROS）的形成，抑制酶的活性，螯合参与自由基生成的微量元素等途径发挥抗氧化作用，清除活性氧，以及上调或保护抗氧化防御系统[28]。同时，花青素类多酚化合物还有一定的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，如具有矢车菊苷元的矢车菊素-3-葡萄糖苷能改善H2O2氧化应激引起的脂肪细胞对胰岛素的抵抗[29]，富含矢车菊素-3-葡萄糖苷的红树莓花色苷提取物对α-葡萄糖苷酶的半抑制质量浓度（IC50）为178.89 mg/L，低于阳性对照阿卡波糖[30]。另外，黑老虎果皮中的维生素C 也具有抗氧化活性，可促进胶原蛋白的形成，具有抗氧化、抗衰老的作用，可用于皮肤美容。

黑老虎种子的主要成分为脂肪酸。有研究结果表明，黑老虎籽含有8 种饱和脂肪酸和4 种不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸总量为2.13×105mg/kg，占脂肪酸总量的87.19%，还含有一些黄酮类化合物（18.4 g/kg）[31]。但对于黑老虎种子中黄酮类化合物具体组成的研究尚未见报道。此外，生物活性成分的组成也受提取方法、提取溶剂的影响。本试验中采用常规溶剂乙醇作为多酚提取剂，在超声波产生的空穴效应作用下，使果皮中更多的多酚类物质释放到溶剂中，但未能对多酚类化合物的具体组成及含量进行检测，后续将通过超高压液相色谱-飞行时间质谱仪（UPLCQ-TOF）等色谱手段进一步对其具体活性成分进行分析。