枣种质果实黄酮含量及其抗氧化活性分析

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（1.山西农业大学 a.果树研究所；b.果树种质创制和利用山西省重点实验室，山西 太原 030031；2.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801）

枣Ziziphus jujubaMill.为鼠李科Rhamnaceae枣属ZiziphusMill.植物，原产于我国，我国枣栽培的历史悠久，枣品种资源丰富。枣是我国的主要经济林树种之一，也是我国的第一大干果树种[1-2]。枣果实富含多糖、环核苷酸（cAMP 和cGMP）、黄酮、三萜酸、皂苷等生物活性成分[3-4]，是名贵的天然保健食品和重要的药用材料，被国家卫生部列为“药食同源”食品[5]。黄酮类物质是枣果中重要的功能性营养成分之一[6]，近年来因其具有天然生物活性而受到人们的广泛关注。已有研究结果表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、镇静催眠、降血脂、降血压、护肝保肝等生理功能[7-9]。因此，研究枣种质果实中黄酮的含量及抗氧化活性对于枣种质的鉴定评价和资源利用均有重要意义。

目前，有关枣种质中黄酮类物质的研究主要集中在提取工艺优化和栽培品种含量分析等方面。张琼等[10]比较分析了以溶剂超声浸提法、微波法和简化QuEChERS 法提取枣果黄酮的效率，并对提取工艺的各参数进行了优化，结果发现，采用简化QuEChERS 法可在30 min 内有效提取枣果黄酮。周晓凤等[11]采用紫外分光光度法测定了10 个枣品种果实中总黄酮的含量，结果表明，各品种的平均含量为3.07 mg·g-1。然而，前人针对枣果实中黄酮的抗氧化能力的研究报道较少。袁亚娜等[12]研究了冬枣黄酮粗提物及其纯化物对超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH 自由基的清除能力，结果发现，冬枣黄酮类物质具有很好的抗氧化效果，并存在剂量效应关系。Gao 等[13]采用DPPH、ABTS 自由基清除能力及总还原力等评价方法测定了10 个栽培枣品种果实的抗氧化能力，结果表明，枣果实均表现出较高的Trolox（抗氧化剂）当量抗氧化能力，供试的10 个品种中，‘佳县木枣’的抗氧化能力最强。但是，关于酸枣资源、观赏资源、栽培品种等不同类型枣种质果实中黄酮及其抗氧化活性的系统研究尚未见诸报道。弄清不同类型种质资源枣果中的黄酮含量，是其资源合理开发与利用的前提。为此，从国家枣种质资源圃中选择了50 份具有代表性的枣种质，对其果实中的黄酮含量及分别以FRAP 法、DPPH 法、ABTS 法等评价方法测得的抗氧化活性进行了比较分析，还研究了黄酮含量与抗氧化活性间的相关性，以筛选出黄酮含量高且抗氧化活性强的优特异枣种质，从而为枣黄酮代谢机理的研究和黄酮功能产品研发时的原料选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016—2018年在山西省农业科学院果树研究所果树种质创制和利用山西省重点实验室进行，从国家枣种质资源圃中选取50 份具有代表性的枣种质脆熟期的果实（枣果半红至多半红）为试材。采样树为13年生的结果树，其种植密度为2.5 m×3.0 m，其栽培条件和管理水平均一致。在果实脆熟期，将采集的样品依次用自来水、蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，切成薄片，置于65 ℃的恒温干燥箱中烘至恒重后粉碎，过80 目筛，然后置于-20 ℃的冰箱中保存以备用。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮提取液的制备

精密称取待测样品各3 份，每份2.000 g，将60%的乙醇20 mL 加入至50 mL 的离心管中，超声提取60 min，以4 000 r·min-1的转速离心5 min，然后将上清液转移到50 mL的容量瓶中，重复提取2次，合并上清液，再以60%的乙醇定容至刻度，即可得到测定黄酮含量和抗氧化活性所用的提取液。

1.2.2 黄酮含量的测定

黄酮含量的测定，采用NaNO2-AI(NO3)3-NaOH比色法，参照Zhao 等[14]的方法（略有改动）进行操作。以芦丁为标准物质绘制标准曲线。

1.2.3 抗氧化活性的测定

采用FRAP 法[15]测定提取物的总还原力，其抗氧化活性以AAE 当量（g·kg-1）表示。

参考Yemis 等[16]和Brand-Williams 等[17]的方法（有所改进），采用黄酮提取液对DPPH 自由基的清除能力评价其抗氧化活性。操作步骤如下：精密称取DPPH 0.039 4 g，用无水乙醇溶解后定容于500 mL 的棕色容量瓶中（每天所用的DPPH溶液都是现用现配的），于4 ℃黑暗条件下保存以备用。将配好的DPPH 溶液1 mL 加入到盛有2 mL 稀释后的黄酮提取液的试管中，立即摇匀，于室温黑暗条件下培养30 min，然后用分光光度计测定517 nm 处的吸光度，记为Ac(t)；再以60%的乙醇代替黄酮提取液，测定517 nm 处的吸光度，记为Ac(0)。以Trolox 为标准物质设置不同浓度梯度，以浓度为横坐标，以吸光度的变化值（Ac(0)-Ac(t)）为纵坐标，建立的回归方程为：Y=0.464 6X-0.090 7，R2=0.993 1。提取液的抗氧化活性，用TE（Trolox当量）表示，其计量单位为mmol·g-1。

参考Nenadis 等[18]和于洋[19]的方法（有所改动），采用黄酮提取液对ABTS+·自由基的清除能力评价其抗氧化活性。操作步骤如下：精密称取ABTS 40.00 mg，将其溶解于10 mL 的蒸馏水中，加入1.0 mg·mL-1的过硫酸钾8.00 mL，于室温避光条件下静置16 h，转移到250 mL 的容量瓶中，再加入32 mL 的蒸馏水，用无水乙醇定容至刻度，放置10 h 以备用。将配置好的ABTS 溶液稀释，在734 nm 处测定到的吸光值约为0.7。将2 mL 稀释后的ABTS 溶液加入到盛有2 mL 稀释后的黄酮提取液的试管中，静置30 min，并测定734 nm 处的吸光度，记为Ai；以60%的乙醇代替黄酮提取液，测定734 nm 处的的吸光度，记为A0。以Trolox为标准物质设置不同浓度梯度，以浓度为横坐标，以吸光度的变化值（A0-Ai）为纵坐标，建立的回归方程为：Y=0.694 7X+0.003 6，R2=0.997 6。提取液的抗氧化活性，用TE（Trolox 当量）表示，其计量单位为mmol·g-1。

1.3 数据分析

采用Microsoft excel 2003 和SPSS 18.0 软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 枣种质果实黄酮含量分析

供试的50 份枣种质脆熟期果实中黄酮含量的分析结果见表1。由表1可知，不同枣种质间果实中的黄酮含量具有丰富的多样性。50 份枣种质脆熟期果实中的黄酮含量为1.46 ～22.50 mg·g-1，其平均值为5.78 mg·g-1，其变幅为22.04，其变异系数为68.26%。其中，黄酮含量最高的种质为北京老虎眼，其含量高达22.50 mg·g-1；含量最低的种质是羊奶枣，其含量为1.46 mg·g-1；前者是后者的14.41 倍。高于平均含量的种质有17 份，低于平均含量的种质有33 份。

表1 50份枣种质脆熟期果实中的总黄酮含量Table1 Total flavonoid contentsin50 Chinesejujubecrisp ripening fruits mg·g-1

Shapiro-Wilk 正态性检验结果表明，50 份枣种质脆熟期果实中黄酮含量的分布规律表现为正态分布规律（P=0.053 ＞0.05）。50 份枣种质脆熟期果实中的黄酮含量分布频率的分析结果如图1所示。由图1可知，50 份枣种质果实中，大部分种质枣果中黄酮含量的分布范围为3.33 ～5.00 mg·g-1，此类种质有16 份，占供试种质总数的32.00%；其次是黄酮含量分布范围分别为5.00 ～6.67、1.67 ～3.33、6.67 ～8.33 mg·g-1的种质，其种质份数分别有12、9、6 份，分别占供试种质总数的24.00%、18.00%、12.00%；而其他含量分布范围的种质较少，如黄酮含量分别为10.00 ～11.67 与15.00 ～16.67 mg·g-1的种质 份 数分别有3 和2 份，分别占供试种质总数的6.00%和4.00%；黄酮含量最低（小于1.67 mg·g-1）和最高（大于20.00 mg·g-1）的种质各有1 份。

图1 50 份枣种质果实中黄酮含量的分布情况Fig.1 Distribution of flavonoid contents in jujube germplasm fruits

2.2 抗氧化能力分析

分别采用FRAP法、DPPH 法、ABTS 法这3 种评价方法测定了不同枣种质果实黄酮提取液的抗氧化能力，结果见表2。表2表明，不同枣种质果实黄酮提取液均有不同程度的抗氧化活性。以FRAP 评价法测得的50 份枣种质果实黄酮提取液的抗氧化能力为2.83 ～18.44 g·kg-1，其均值为6.39 g·kg-1，其变幅为15.61，变异系数为44.77%。以DPPH 自由基清除能力评价法测得的50 份枣种质果实黄酮提取液的抗氧化能力为1.02 ～2.82 mmol·g-1，其 均 值 为1.70 mmol·g-1，其变幅为1.80，变异系数为23.53%。以ABTS 自由基清除能力评价法测得的50 份枣种质果实黄酮提取液的抗氧化能力为3.42 ～5.98 mmol·g-1，其均值为4.38 mmol·g-1，其变幅为2.56，变异系数为14.02%。采用3 种抗氧化活性评价方法测定的结果均表明，果实黄酮提取液抗氧化活性较强的枣种质分别为北京老虎眼、溆浦圆酸枣、献县酸枣、北京鸡蛋枣、算盘枣、义乌棉絮枣等。

2.3 相关性分析

对50 份枣种质果实中的黄酮含量与分别以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法这3 种抗氧化能力评价方法测得的黄酮提取液的抗氧化能力间的相关性进行了分析，结果见表3。表3表明，分别以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法这3 种抗氧化能力评价方法测得的黄酮提取液的抗氧化能力与枣果实中的黄酮含量间均呈极显著正相关，其相关系数分别为0.916、0.827、0.659。分别以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法评价得出的枣种质果实黄酮提取液的抗氧化能力间也呈极显著正相关，其中，FRAP 和DPPH、FRAP 和ABTS、DPPH 和ABTS间的相关系数分别为0.799、0.753、0.573。

2.4 聚类分析

以50 份枣种质脆熟期果实中的黄酮含量为依据，采用系统聚类（Hierarchical clustering）中的Ward 法，以Euclidean 距离为遗传距离进行聚类分析，结果如图2所示。在遗传距离为10.0 处可将供试枣种质分为3 大类。第1 类包含北京老虎眼、溆浦圆酸枣、献县酸枣、算盘枣、北京鸡蛋枣、北京酸枣等6 份种质，其黄酮含量≥10.00 mg·g-1，此类种质数占供试种质总数的12.00%，可将此类种质定义为高黄酮含量类群，该类群主要为一些酸枣资源。第2 类包含义乌棉絮枣、大柿饼枣、早红蜜、黄骅冬枣、临猗梨枣等种质，此类种质共有18 份，5.00 mg·g-1≤黄酮含量＜10.00 mg·g-1，此类种质数占供试种质总数的36.00%，可将此类种质定义为中等黄酮含量类群。其余26 份种质都聚到第3类中，包括乐陵小枣、郎家园枣、保德油枣、枣强婆枣、夏津大白铃等种质，此类种质数占供试种质总数的52.00%，其黄酮含量＜5 mg·g-1，可将此类种质定义为低黄酮含量类群。这一聚类分析结果可为今后有关枣种质果实中黄酮类物质的研究与利用提供参考依据。

表2 50 份枣种质果实黄酮提取液的抗氧化能力Table2 Antioxidant capacity of fruits in 50 Chinese jujube germplasms

表3 枣种质资源果实中黄酮含量与抗氧化能力的相关性†Table3 Correlation of flavonoid content and antioxidant capacity in Chinese jujube fruits

3 结论与讨论

黄酮类物质是枣果实中的重要功能性营养成分之一，前人相关研究的供试品种主要是栽培品种，鲜有选用酸枣类、观赏枣等不同类型种质来系统评价枣果实中黄酮的含量及抗氧化活性的研究报道。赵爱玲等[14,20]测定了50 个枣品种果皮中的黄酮含量，结果得出，枣果皮的黄酮含量高于枣果肉的黄酮含量。成熟果实是枣树的主要利用部位[21]，本试验研究了50 份具有代表性的枣种质脆熟期果实中的黄酮含量，结果发现，枣种质果实中黄酮含量的分布范围较为广泛，不同种质间其含量差异明显，这与姜帆等[22]对枇杷花中黄酮含量的研究结果一致。以50 份枣种质脆熟期果实中的黄酮含量为依据进行了聚类分析，结果表明，果实中黄酮含量高的种质大多为酸枣资源，黄酮含量中等和较低的种质大多为栽培品种。因此，开发黄酮功能产品时，应选择含量较高的种质果实为原料。枣和酸枣是枣属植物中最重要的两个种，枣较酸枣进化[23]，酸枣资源果实中黄酮含量高的原因可能是，其在进化为枣的过程中次生代谢物的代谢途径发生了变化。前人研究结果表明，黄酮类物质含量与抗逆性有关[24]。酸枣长期处于野生状态中，其抗逆性较枣更强，这可能与其黄酮含量较高密切相关。黄酮含量受多种因素的影响[25]，是由遗传因素和环境条件共同决定的。关于枣种质黄酮类物质的代谢机理尚需从分子水平上进行深入研究。

图2 50 份枣种质果实黄酮含量的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of flavonoid contents of 50 jujube fruits

已有研究结果表明，黄酮类物质具有抗氧化活性，能有效清除自由基[26]。枣果的“药食同源”保健功能越来越受到人们的重视，这与其抗氧化活性等天然生物活性密不可分。本研究采用目前最常用的FRAP 法、DPPH 法、ABTS 法等3 种评价抗氧化能力的方法，分析了50 份具有代表性的枣种质脆熟期果实黄酮提取液的抗氧化活性，结果表明，枣种质果实黄酮提取液均有一定的抗氧化活性，其果实黄酮含量与以此3 种评价方法测定的抗氧化能力间均呈极显著正相关，说明这3 种方法在评价抗氧化能力方面具有协同性与相似性，也进一步验证了结果的可靠性，这与其他果树（如李[27]、核桃[28]等）的研究结果一致。据此可根据黄酮含量的高低初步判定种质抗氧化活性的强弱。

本研究初步建立了枣种质黄酮含量的分级标准（高含量、中等含量、低含量），筛选出黄酮含量高且抗氧化活性强的枣种质12 份，其分别为酸枣种质4 份（北京老虎眼、溆浦圆酸枣、献县酸枣、北京酸枣）、观赏种质2 份（算盘枣、大柿饼枣）和栽培枣种质6 份（北京鸡蛋枣、义乌棉絮枣、早红蜜、黄骅冬枣、临猗梨枣和新疆小圆枣）。枣果中黄酮类物质的组分有多种，不同组分发挥着不同的生理功能，测定总黄酮含量及抗氧化活性，可初步了解不同种质枣果中黄酮含量的分布情况。今后可进一步采用液相色谱、气质联用、液质联用等技术[29]鉴定枣果中黄酮类物质的组分，深入研究各组分的主要生理功能，并采用转录组、代谢组学等分子生物学手段研究其代谢途径和调控机理，从而为高黄酮含量枣种质的创制和黄酮功能产品开发时原料的选择及种质资源的综合开发与利用提供理论参考依据。