基于SSR分子标记的枸杞遗传多样性研究

，，，，，

（1.南京林业大学，江苏 南京 210037；2.青海省海西蒙古族藏族自治州农业科学研究所，青海 海西 817000）

枸杞Lycium barbarumL.是茄科Solanaceae 枸杞属LyciumL.多年生落叶灌木，主要分布在青海、新疆、宁夏、甘肃等省区[1]。枸杞十分抗旱、耐盐，多生长在盐碱地和荒漠中，对恶劣的条件有很强的适应性[2]。枸杞果实含有大量的花青素[3-4]、多糖[5-7]、酚酸[8-9]等次生代谢物质，具有较高的药用价值，长期食用能预防多种疾病，所以目前有关枸杞果实次生代谢物的研究报道较多。然而，在长期的人工选育过程中，枸杞的基因型高度杂合，遗传背景变得十分复杂[10]，因此，许多研究学者开始从分子生物学的角度对枸杞种质资源的遗传多样性展开研究。近年来，国内外的研究者利用DNA 分子标记技术（如ISSR[11-12]、SCoT[13]、AFLP[14-15]、RAPD[16]、SSR[17-19]、SRAP[20]等）对枸杞种质资源的遗传多样性进行了研究。

SSR 标记是依据生物基因组中1 ～6 个核苷酸串联重复的DNA 序列特性开发的一种分子标记技术，具有多态性高、共显性遗传等优点，被广泛应用于遗传图谱构建、种质资源鉴定和遗传多样性分析等[21-26]方面。但是，由于缺乏基因组信息，基于基因组测序开发SSR标记的传统方法成本高，步骤复杂[27]，SSR 在枸杞种质资源的研究中受到极大的限制。近年来，通过转录组数据开发多态性SSR 分子标记的植物研究有许多报道：姚俊修等[28]利用西洋接骨木的转录组数据开发了25 对具有多态性的荧光SSR 分子标记，并对8 个不同种的接骨木进行了遗传多样性分析；黄海燕等[29]通过分析杜仲转录组数据开发了20 对具有高多态性的EST-SSR 引物，其研究结果表明，利用以植物转录组数据开发的相关SSR 引物进行植物遗传多样性研究是可行的；Chen 等[30]分析了黑果枸杞转录组信息并进行了SSR 分子标记的开发，还利用所开发的SSR 标记将9 个不同群体的野生黑果枸杞分为3 组；尹跃等[31]利用黑果枸杞转录组信息开发了28 对高多态性引物，并对24 份枸杞的种质进行了区分，其研究结果表明，黑果枸杞转录组信息可以作为开发SSR标记的有效来源信息。

目前，有关不同地域黑果枸杞遗传多样性的研究报道较少。因此，本研究以美国生物技术信息中心（NCBI）公布的黑果枸杞果实转录组数据为基础，挖掘转录因子SSR 引物，分析不同地理种源的黑果枸杞和不同栽培种的红果枸杞的遗传多样性，在分子水平上为黑果枸杞新品种的鉴定和保护提供准确、客观和公正的判定条件，同时印证了以转录组数据开发黑果枸杞SSR 标记的可行性，以期为黑果枸杞的种质资源开发和遗传多样性分析提供有意义的参考标记。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的30 份枸杞材料由两部分构成：一部分为青海省海西蒙古族藏族自治州农业科学研究所枸杞院士工作站枸杞种质资源圃中保存的25 份枸杞材料，其中5 份为黑果枸杞，1 份为黄果枸杞，19份为红果枸杞；另一部分为2018年7月在新疆维吾尔自治区和甘肃省等省区野外采集的5 份野生黑果枸杞。供试的30 份枸杞材料的基本情况见表1。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA 的提取

利用Magen 植物组织DNA 提取试剂盒提取枸杞叶片总DNA，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度，用Nanodrop 核酸蛋白分析仪检测其浓度，然后将其稀释为50 ng·µL-1并保存于-20 ℃的冰箱中以备用。

1.2.2 转录组数据处理及引物设计

从NCBI的GenBank 数据库中下载黑果枸杞转录组数据，登录号为SRR2344923。将下载到的转录组数据通过Trinity 组装软件进行序列组装，然后利用MicroSAtellite（MISA http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）工具搜索Unigene 序列的SSR位点，参照尹跃等人[31]所用的方法和标准进行搜索。采用Primer Premier 3.0 软件对含有SSR 位点的序列设计引物[28]，引物设计参数为：引物长度为18 ～27 bp，GC 为40%～60%，退火温度为50 ～60 ℃，PCR 扩增长度为100 ～300 bp，其他参数均设为默认值。

表1 30 份枸杞材料的基本信息Table1 The information of 30 L.barbarum

1.2.3 引物的筛选

引物由南京擎科生物技术公司合成，PCR反应所需的2×Taq PCR MasterMix 及DNA marker均购买于擎科生物（南京）有限公司。从供试材料中选取植物表型性状差异较大的6 份样品的DNA 模板对116 对引物进行筛选，最终选择条带清晰、稳定性和多态性均好且对6 份样品均有较好鉴别力的20 对引物用于所有样品的PCR 扩增，20 对引物的序列信息见表2。

1.2.4 SSR-PCR 反应体系

采用15 µL 的PCR 扩增反应体系：DNA 模板1 µL (50 ng·L-1)，2×Taq PCR Master Mix（含有Taq 酶、dNTP 和缓冲液）8 µL，上、下游引物各1 µL（10 µmol·L-1），去离子水15 µL。PCR 扩增反应程序为：94 ℃，预变性4 min；94 ℃，变性30 s；退火温度56 ～60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；最后，72 ℃，延伸10 min，于4 ℃条件下保存。

1.2.5 PCR 产物的检测

先用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物有无特异性位点，对有特异性位点的样品，再用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后用荧光染料染色，用生物电泳图像分析系统进行观察、拍照。

表2 SSR 引物序列信息Table2 The information of SSR primer sequences used in this study

1.3 数据处理

采用Excel 软件统计电泳图中的谱带，按照扩增条带分子量的大小在相同迁移位置读取，有条带的记为1，无条带的或无法辨别的带型记为0，构建“0,1”矩阵。利用Popgene 32 软件计算Nei’s的遗传多样性指数（H）、Shannon 信息指数（I）、扩增总条带数和多态性位点百分率（PPL）等遗传参数[32]，使用PIC_calc 0.6 软件计算各引物位点的多态信息含量（PIC）。利用NTSYS-pc 软件计算品种间遗传相似系数（GS），并按UPGMA 方法进行聚类分析[13]，采用GraphPad Prism 8 软件优化遗传相似系数矩阵，构建30 个枸杞品种的聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 SSR 引物扩增结果分析

扩增统计结果见表3。表3表明：用筛选出的20 对SSR 引物分别对30 个枸杞品种进行SSRPCR 扩增，从20 对SSR 引物中共扩增出121 条条带，平均每个引物扩增6.05 条，扩增出的条带数大多为2 ～8 条。不同引物扩增出的多态性条带数量差异较大，其中扩增条带最多的引物为P1-5，其条带为16 条，扩增条带最少的引物为P3-26，其条带为2条。引物P1-5的部分扩增结果如图1所示。30 份枸杞材料的有效等位基因数（Ne）的变化范围为1.201 6 ～1.682 8 个，其均值为1.473 1 个；Nei’s 多样性指数（H）的变化范围为0.150 3 ～0.391 5，平均值为0.291 7；Shannon 信息指数（I）的变化范围为0.265 4 ～0.576 5，平均值为0.451 7；多态信息量（PIC）范围为0.325 ～0.898，平均值为0.667。一般认为，当PIC ＜0.25 时，该引物为低度多态性信息引物；当PIC ＞0.50 时，该引物则为高度多态性信息引物[33]。因此，所选引物大部分为高度多态性信息引物，说明这些引物均可用于枸杞种质资源的鉴定和研究。

2.2 遗传相似性与聚类分析

采用Excel 软件将30 份枸杞样品与122 个位点统计为原始矩阵，再以NTSYS-pc 2.1 软件计算30 份枸杞材料间的遗传相似系数（GS），计算结果如图2所示。由图2可知，任意两份材料之间的相似系数为0.459 2 ～0.991 8，其平均GS 值为0.725 5。

基于30 份枸杞材料的遗传相似系数，用UPGMA 法对其进行聚类分析，结果如图3所示。由图3可知，在遗传相似系数0.62 处，30 份枸杞材料可聚为如下6 个组。第I组包括10 份黑果枸杞，青海（H1、H2、H3、H4、H5、H6）、新疆（H7、H8、H9）、甘肃（H10）的黑果枸杞聚为一类，青海和新疆的黑果枸杞的遗传距离较近，而与甘肃黑果枸杞的遗传距离较远。第Ⅱ组有紫果枸杞（R13）、黄果枸杞（R14）和水果枸杞（R15）共3 份材料；紫果枸杞可能由于在培育杂交新品种研究中以黑果枸杞为亲本，导致其基因和本身性状都趋近于黑果枸杞；黄果枸杞与水果枸杞聚为一类，说明青海当地栽培的水果枸杞与黄果枸杞的亲缘关系较近，这与其研究所用亲本的遗传关系相近有关。第Ⅲ组包括抗旱优良品种与花用枸杞和多果类枸杞。第Ⅳ组所聚品种数最多，占试验材料的36.7%；其中，柴杞1号（R2）和柴杞3号（R3）、柴杞2号（R4）和高产抗病型（R6）、茶用枸杞（R9）和R12 之间均表现出非常近的亲缘关系，它们均来自于青海省德令哈市尕海镇的枸杞良种繁育基地，其亲本来源种质成分可能有一定的相似性；被聚在一类的R11、R18、R19 均为新培育的植株材料，说明它们具有相似的遗传背景。第Ⅴ组包括菜用枸杞（R1）与叶用枸杞（R8）。第Ⅵ组为发现于青海省德令哈市尕海镇的野生红枸杞。第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组内的栽培枸杞的遗传相似系数均较高，说明其遗传距离越近，亲缘关系也就越近。这可能由于枸杞种质资源比较丰富且栽培历史悠久，属内种间（渗透）杂交现象普遍，加之地方品种本身无科学命名，导致品种资源类型多且名称混乱[34]。

表3 供试枸杞材料遗传多样性的扩增统计结果Table3 The statistics of genetic diversity of L.barbarum

图1 引物P1-5 对30 份枸杞材料的部分扩增结果Fig.1 Amplified 30 samples results partly by primers P1-5

图2 供试的30 份枸杞材料的遗传相似系数Fig.2 Genetic similarity coefficient of 30 samples of L.barbarum

图3 供试的30 份枸杞材料的聚类分析结果Fig.3 Cluster analysis results of 30 samples of L.barbarum

3 结论与讨论

分子标记技术被广泛应用于各类物种遗传资源的研究中，关于利用不同分子标记技术对枸杞的遗传多样性与亲缘关系的研究报道较多[11,13,16-17,20]。本研究利用黑果枸杞转录组数据开发出枸杞SSR引物，对10 份不同地域的黑果枸杞及20 份不同栽培型的红果枸杞进行了分子标记分析。从182对引物中共筛选出20 对多态性SSR 引物。对青海、新疆、甘肃这3 个省区的10 份黑果枸杞、20 份栽培红枸杞品种进行了遗传多样性分析，计算出了不同材料间的遗传距离，明确了30 份材料间亲缘关系的远近，研究结果表明，基于黑果枸杞转录组数据开发的引物可以用于枸杞品种的鉴别，20 对引物的多态性信息量丰富，平均为0.667，这一结果稍低于尹跃等[31]的研究结果；其次，将10 份黑果枸杞再作聚类分析，青海、新疆、甘肃的黑果枸杞被区分开来，这一结果与Chen 等[30]的研究结果一致，说明以黑果枸杞转录组数据开发的SSR 分子标记可以从分子水平上鉴别黑果枸杞品种的差异；尤其是H1 和H2、H4 和H6 之间的遗传相似系数均高达0.991，这充分说明了基于黑果枸杞的转录组数据开发的SSR 引物能有效地鉴别黑果枸杞的品种差异。此结果也印证了Ono等[35]的“用石榴皮转录组信息开发了SSR 分子标记，并且可以有效地对石榴品种进行鉴别，说明了从转录组数据中开发SSR 分子标记的可靠性”这一研究结果。本研究筛选出的20 对SSR 引物，可以用于黑果枸杞品种鉴定和黑果枸杞分子辅助遗传育种等方面的研究之中。

本研究所用材料主要来源于青海省德令哈市尕海镇枸杞良种繁育基地，但是，研究中出现了聚类分析结果与品种来源信息不相符的情况，如黄果枸杞、水果枸杞与黑果枸杞的遗传距离相对较近，但其性状却存在很大的不同，其原因可能是，所用引物数量有限，扩增的多态性条带较少，不能充分表现材料本身的特异性，因此需要进一步开发黑果枸杞的SSR 引物。传统SSR 分子标记的开发所需费用高，而通过转录组数据开发SSR 引物，不仅可以开发出针对表型的特异性SSR 引物，而且所开发出的引物还具有种属间良好的通用性，还可省时省力，节约成本。

本研究基于转录组数据开发并筛选出多态性较好的20 对SSR 引物，不仅可应用于分析现有枸杞属种质资源的遗传多样性，还可以应用于黑果枸杞种质的遗传多样性分析。由于目前收集到的黑果枸杞种质资源相对较少，本研究仅对目前青海省德令哈市枸杞良种繁育基地中收集、保存的黑果枸杞进行了评价，所用的引物仅来自于黑果枸杞果实转录组数据中的一部分，因此应开发和挖掘更多的SSR 引物进行综合深入的评价分析。在今后的黑果枸杞研究工作中，还应收集国外的黑果枸杞种质资源，挖掘国内枸杞属野生种质资源，进一步丰富黑果枸杞的转录组数据；开发新的SSR 引物，丰富现有引物数据；利用分子辅助育种方法创新研究黑果枸杞种质资源。