显微光谱成像装置研制与实验设计

刘东奇，孔勇发

（南开大学 物理科学学院，天津 300071）

显微光谱成像技术是一种通过有机整合光学显微成像技术和光谱分析技术，给出待测样品光学分辨率下的空间位置信息和与之相对应的光谱信息的成像探测技术。该技术实现了空间显微成像分辨能力和光谱探测能力的优势互补，可以完成光学分辨率下的空间成像和位置定位，同时可以提供样品的光谱成分分析以及不同光谱成分的选择性成像。显微光谱成像技术在生物荧光成像、医学成像、荧光材料研制等领域都有着广泛应用，是在这些领域中进行科研的有效实验手段[1-6]。

近些年来，如何将科学研究中常用的一些实验技术融合到实验教学中是高校实验教学改革的热点课题之一[7-8]。目前，南开大学物理实验教学中心在已开设的物理实验课程基础上，依托本校优势学科和已设立的自制实验教学仪器设备等项目，正在逐步将部分研究成果转化为具体的物理实验教学内容，为物理实验教学改革提供有益的尝试。基于此，本实验中心尝试研制了显微光谱成像装置，并自行编写了该装置的控制和成像软件。该装置主要通过振镜将激发光束反射进入显微物镜聚焦在样品某一位置处，此位置处的样品经激发后发出荧光，荧光被同一物镜收集，透过双色镜后进入荧光采集光路，探测器获取该位置处的荧光和光谱数据；通过有序控制光谱仪和振镜，计算机将有序采集的某一区域的光谱信号和相应位置信息进行数据处理，获得该区域样品的显微光谱图像。基于该光谱成像装置，设计了自组荧光显微镜、白光照明成像、荧光光谱测量和光谱成像等实验内容。

1 光谱成像装置的光路设计和搭建

自组显微光谱成像装置是基于我校物理实验教学中心已搭建的自组荧光显微镜，通过在自组荧光显微镜光路中加入振镜装置实现对激光光束和荧光光束的位置控制，再通过编写软件有序控制振镜和光谱仪之间的联动，实现显微光谱成像功能。其中，自组荧光显微镜的搭建可参见文献[9]。显微光谱成像装置的光路设计见图1，主要由光源光路、可控激光扫描光路和荧光收集光路等组成，具体包括激光光源、白光光源、平面反射镜、可移动位置的平面反射镜、双色镜、扫描振镜、透镜、物镜、三维平移台、荧光样品、CMOS相机、光纤光谱仪等。光源光路包括532 nm 激光光源和白光光源，两者可以通过可移动的平面反射镜实现激光激发成像和白光照明成像之间的自由切换。激光光束经双色镜和振镜反射后，依次经过透镜、物镜后聚焦到装载于三维平移台的样品上，样品受激发出的荧光被同一物镜收集，经透镜、振镜、双色镜进入后方荧光采集光路，后方的CMOS 相机完成荧光图像采集或白光照明图像采集，光纤光谱仪完成光谱数据的采集，两者可以通过可移动的平面反射镜实现CMOS探测光路和光纤光谱仪光路的自由切换。通过计算机控制振镜位置，进而控制激光光束聚焦位置和荧光采集位置，再通过计算机软件有序控制振镜和光谱仪之间的联动，实现样品的逐点扫描、光谱数据的采集和实时处理以及光谱图像的获得。

图1 显微光谱成像装置光路

显微光谱成像装置的光学元件主要从大恒光电公司和索雷博公司购置。所用的荧光样品为CdTeCdS量子点。整个装置采用反射式光路，激发光路和荧光光路共用同一物镜，且配有白光光源可以随时完成白光照明成像，光学图像清晰，配合三维平移台的操作可以方便地随时观察大范围样品和定位样品区域。该装置的光谱测试范围为350～1 050 nm，可以完成可见光到近红外光范围内的光谱信号采集和分析。

2 显微光谱成像

显微光谱图像采集工作由自行编写的计算机控制软件完成。图2 是光谱成像软件的控制流程图。光谱成像软件的整个工作流程如下：利用LabVIEW 编写程序，控制扫描振镜和光谱仪；计算机主机上的主程序输出坐标位置（Xi, Yi）给扫描振镜，扫描振镜的X轴驱动电机和Y 轴驱动电机带动反射镜转动，使光斑移动到（Xi, Yi）位置处；光纤光谱仪采集此处的荧光光谱并存储，主程序提取光谱数据，获得坐标（Xi, Yi）处的特定波段的荧光光谱强度值并存储；随后主程序输出坐标位置（Xi+1, Yi+1）给扫描振镜，重复后续过程，获得坐标（Xi+1, Yi+1）处的光谱数据；依次改变坐标位置，重复上述过程N 次，最终可获得某一区域内的样品光谱图像。

图2 光谱成像软件控制流程图

以CdTeCdS 量子点为测试荧光样品，衬底为石英。532 nm 激光光束激发样品，可移动的平面反射镜将荧光光路切换到光谱仪光路，荧光信号经透镜聚焦后通过光纤进入光谱仪完成光谱采集。图3 是光纤光谱仪采集的量子点样品的荧光光谱曲线，采集时间10 ms。从图中可以看到，该量子点样品的荧光峰值位于717 nm 处，整个荧光光谱范围为650～800 nm，半高宽72 nm。

图3 量子点荧光光谱

为了验证整个装置的显微光谱成像能力和所编控制软件的可行性，在量子点荧光样品上做了一个十字形的标记。首先通过光路中的可移动平面反射镜切换成白光光源照明光路，荧光光路切换到CMOS 白光照明图像采集光路，通过三维平移台移动样品位置，使得十字形标记进入CMOS 相机视野中，调整合适的样品位置后，得到十字形标记所在区域的白光照明灰度值图像，如图4(a)所示；随后通过搭建的显微光谱成像装置对该十字形标记所在区域进行荧光光谱图像采集，设定单个光谱的采集时间为10 ms，共采集10 000组光谱数据，获得的十字形标记所在区域的光谱图像如图4(b)所示，图中所用颜色为伪色，对应光谱强度值。为了凸显十字形标记所在区域的白光照明图像和光谱图像以便相互对照，图4(a)和4(b)仅显示了部分成像结果。从图4 可以看到，白光照明图像和光谱图像中的十字形标记均清晰可见，形状一致，表明两者的成像区域是同一样品区域。图4(b)中用红色虚线标记的区域，其荧光光谱强度为背景强度，表明此处没有量子点，这与图4(a)中相同位置区域的白光照明图像相对应，图4(a)中显示灰白色，表明此区域没有量子点或量子点极少，白光光束直接被石英衬底反射进入探测光路。图4(b)中用红色实线标记的区域，其荧光光谱强度值较大，表明这些区域有较多的量子点聚集，这与图4(a)中相同位置区域的白光照明图像相对应，图4(a)中显示灰黑色，表明这些区域量子点较多，白光光束照射到量子点样品上时，发生漫反射，仅有较少的白光被物镜收集进入探测光路。因此，获得的光谱图像和白光照明图像是一一对应的，表明我们的显微光谱成像装置和自行编写的相应控制软件是可以完成显微光谱成像测试的。

图4 同一区域的量子点白光照明图像和荧光光谱图像

3 结语

在高校物理实验教学课程中，光谱仪相关实验是一类基础的、已被广泛采用的物理光学实验[10-12]。本文通过自组显微光谱成像装置和相关的实验设计，以量子点荧光光谱测量和光谱成像为着力点，将科学研究中常用的光谱分析手段和显微成像手段融合进高校物理实验教学中，对物理实验教学方法和教学内容进行了大胆的改革探索，这将帮助学生在夯实光谱仪相关的基本实验技能和光路调节能力的基础上，进一步拓宽科学研究视野，领会光谱成像相关技术。通过接触振镜和光谱仪等硬件的控制和相关软件程序的编写模式等方式，期望能够培养和提高学生的科学素养和创新能力，为提高本科物理实验教学水平和高校学生的培养质量提供有益的思路。