非小细胞肺癌组织中lncRNA DB327252的表达及临床意义

胡思远 陈 燕 朱佳龙 侯 量 尹来波

(石河子大学第一附属医院心胸外科，石河子 832000)

随着环境变化，肺癌的发病率逐年增高，严重影响公众健康[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的一种类型，占全部肺癌的80%左右[2]。以CT为代表的影像学方法是临床上筛查NSCLC的主要手段，但由于肺组织本身的质地、影像学诊断方法的灵敏度，并不能完全满足临床需要[3]。因此寻找NSCLC的新型筛查与早期诊断方法，加强检测手段灵敏度，同时减少检测造成的创伤与花费，是提高NSCLC临床诊疗方案的发展方向。随着表观遗传学不断发展，研究者发现肺组织的癌变的一大因素是多种基因的异常改变，包括编码区及非编码区靶基因的抑制或过表达[4]。长链非编码(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200 nt的不编码蛋白质的RNA，研究表明，lncRNA通过调控基因的表达广泛参与机体的多种生理、病理过程，尤其在多种恶性肿瘤中异常表达，有成为肿瘤标记物的潜力[5]。本研究选择lncRNA DB327252为研究对象，以实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法检测lncRNA DB327252表达，以探讨其在NSCLC的发生与恶性进展过程中的作用，并预测其成为NSCLC诊断、预后相关肿瘤标志的可能性。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 经本院医学伦理委员会批准，患者及家属知情同意，选取2015年6月～2017年3月我院收治的NSCLC患者91例，后依据排除标准排除11例，因失访排除1例，共入组79例。本院NSCLC确诊标准依据2015年第1版《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》[6]。样本由根治性或姑息性切除术于术中切取，NSCLC组织取自肿瘤组织中心，癌旁组织为肿瘤边缘的正常组织。另取20例同期肺外伤患者的正常肺组织作为对照。本研究选择的NSCLC患者中，年龄≤55岁35例，55岁以上44例，平均年龄(59±7.22)岁；男性45例，女性34例；病历资料显示无吸烟史31例，有吸烟史48例；经病理科诊断，组织学类型为腺癌49例，鳞癌29例，鳞腺癌1例；肿瘤直径≤3 cm者45例，>3 cm者34例；依据2009年修订后的第7版NSCLC国际分期[7]分为：TNM分期Ⅰ期3例，Ⅱ期31例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；无淋巴结转移27例，有淋巴结转移52例。

本研究纳入标准为：①临床病历资料、随访资料完整，冻存标本保存完好；②经病理科确诊为原发性NSCLC；③术前未经放、化疗等其他抗肿瘤手段治疗。排除标准为：①患者未遵医嘱按疗程治疗；②患有影响qRT-PCR结果的疾病；③患有显著影响生存时间的其他严重疾病；④患者意外身故。

1.1.2试剂与仪器 TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)；PrimeScript RT试剂盒(日本TaKaRa公司)；DEPC处理水(信帆生物)；BeyoFASTTMSYBR qPCR Mix(上海联迈生物工程有限公司)；逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)；无水乙醇和氯仿均购自国药集团。UV-8000型紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)；T100型PCR仪(美国Bio-Rad公司)；S700型切片机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；PRO200型电动匀浆机(德国FLUKO公司)；移液枪(吉尔森P型移液器公司)。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR检测lncRNA DB327252表达 每份冻存标本称取100 mg样本，TRIzol法提取总RNA，以紫外分光光度计检测总RNA纯度，取OD260/OD280在1.8～2.0之间的总RNA样本。利用PrimeScript RT试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。qRT-PCR反应体系为30 μl，检测过程严格遵循BeyoFastTMSYBR qPCR Mix说明书。以GAPDH为内参，反应引物序列为：①lncRNA DB327252：F：5′-AGCTCTCCTTCCCCTCTCAG-3′，R：5′-ATCTGAATGCCAGCAAGGCT-3′；②GAPDH：F：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，R：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。 以2-ΔΔCt法计算lncRNA DB327252的相对表达量。

1.2.2随访 以患者出院为观察起点，利用电话、电子通讯，结合患者复诊病历，对患者及家属进行随访。随访截止于2017年12月，随访时长9～21个月，平均(12.79±5.67)个月，中位随访时长为11个月。

2 结果

2.1lncRNA DB327252在不同肺组织中表达 由表1可知，lncRNA DB327252在NSCLC组织中表达水平(2.472±0.381)明显高于癌旁组织(1.267±0.179)与正常肺组织(1.005±0.213)(P<0.05)。

2.2NSCLC 组织中lncRNA DB327252表达水平与临床病理参数关系 NSCLC组织中lncRNA DB327252的表达水平与吸烟史、组织学类型、肿瘤大小、TNM分期密切相关(P<0.05)，与患者年龄、性别、淋巴结转移无关(P>0.05)。见表1。

表1 NSCLC组织中lncRNA DB327252的表达与患者临床病理参数关系Tab.1 Relationship between expression of lncRNA DB327252 in NSCLC tissues and clinicopatholo-gical parameters of

2.3NSCLC 组织中lncRNA DB327252表达水平与患者预后的关系 以NSCLC组织中lncRNA DB327252表达水平的算术平均数0.472将患者分为低表达组38例与高表达组41例，将随访结果绘制成Kaplan-Meier生存曲线(图1)。由此可知，lncRNA DB327252低表达组患者生存率为67.6%，中位生存时间为(46.92±3.30)个月，95%CI为(35.74，47.18)个月，lncRNA DB327252高表达组生存率为34.1%，中位生存时间为(41.46±12.92)个月，95%CI为(340.466，53.37)个月。Log Rank统计结果显示，lncRNA DB327252低表达组患者预后显著优于lncRNA DB327252高表达组患者(χ2=7.900，P=0.005)。

图1 Kaplan-Meier分析NSCLC 组织中lncRNA DB327252的表达对患者预后的影响Fig.1 Kaplan-Meier analysis of effect of expression of lncRNA DB327252 in NSCLC tissues on prognosis of patients

3 讨论

据公共卫生部门统计，在我国，以NSCLC为代表的肺癌的发病率及死亡率具有一定的性别差异，其中男性发病率及死亡率均为所有恶性肿瘤最高，女性发病率为第四，死亡率位居第二，均属于恶性肿瘤的前列，是我国国民健康的一大威胁[8]。NSCLC初期症状较轻，以胸部隐痛、闷痛等非特异性症状为主，影像学特征不明显，多数患者确诊时已为晚期，5年生存率仅20%左右[9]。外科手术结合术后化疗、放疗等综合抗肿瘤治疗方案是目前临床上治疗NSCLC的主要手段[10]。目前临床确诊NSCLC的金标准依然是常规病理切片光镜检查，但由于肿瘤组织的异质性、切片部位大小及诊断医师的能力等多种因素，一般无法做到准确的分型，进而影响治疗方案的个体化，临床上治疗方案总体有效率仅在30%上下波动，患者的中位生存时间仅为1年左右[11]。因而临床亟需寻找能够应用于早期诊断、明确诊断及评估患者预后的生物标记物。

关于肿瘤生物学机制的研究，一开始的焦点在于各种编码蛋白质基因的表达调控与突变，随着表观遗传学的发展，研究者发现非编码基因同样具有重要的生物学功能[12]。依据转录本长度而得名的lncRNA是非编码RNA中研究较少的一类，近来的研究表明lncRNA与机体的各项生理与病理活动密切相关，基因层级上表现为参与基因转录调节与转录后调节、细胞周期调控等，临床上则与心血管系统、退行性疾病、结核等感染性疾病及多种肿瘤的发生发展及预后相关[13-21]。由于研究时间较短，目前功能明确的lncRNA仅有少数，但已发现数种lncRNA与NSCLC相关。Zhang等[22]对比NSCLC与非肿瘤癌旁组织中多种lncRNA的表达情况发现，促癌基因lncRNA HOTAIR、H19与MALAT1在NSCLC组织中呈高表达，而lncRNA PANDAR与TUG1的表达则被显著抑制，同时后续随访结果则表明纳入该研究的lncRNA均显示出显著的预后评估功能。Sun等[23]则发现，lncRNA XIST的表达与NSCLC对顺铂的耐药性相关，而敲除了lncRNA XIST的肿瘤组织耐药性有所回落，因此lncRNA XIST可能作为促进化疗药物疗效的靶点得到临床应用。本研究则探讨了一种新的lncRNA在NSCLC临床诊疗活动中可能的应用前景。

本研究结果显示，lncRNA DB327252在NSCLC组织的表达显著高于非肿瘤癌旁组织与正常肺组织中，因此lncRNA DB327252有成为肺癌早期筛查标志的潜力。而具有吸烟史、肿瘤较大、TNM分期较晚的NSCLC患者组织中lncRNA DB327252的表达显著高于对照组，且与性别、年龄无关，提示lncRNA DB327252的表达与NSCLC的恶性程度相关，其可能参与NSCLC的恶性进展。同时，lncRNA DB327252的表达与淋巴结转移无关，提示lncRNA DB327252对NSCLC的促进应当在于肿瘤细胞的增殖、凋亡等方面，而与转移、侵袭无关。但具体的机制尚需进一步的实验证实。

本研究随访结果显示，lncRNA DB327252表达较高的患者组生存时间、生存率等预后指标均显著差于lncRNA DB327252表达较低的患者组，因此lncRNA DB327252具有一定的预后评估潜力。对lncRNA DB327252表达较高的NSCLC患者，应适当采用联合抗肿瘤治疗方案，注意复诊，加强监护，以改善患者预后。

综上所述，lncRNA DB327252在NSCLC组织中异常高表达，lncRNA DB327252表达较高的NSCLC恶性程度较高，且与患者预后相关。因此lncRNA DB327252有成为NSCLC早期筛查、预后评估相关肿瘤标记物的潜力。