基于体外溶出度与体内生物利用度的西罗莫司增溶技术研究

张雪婷，云 超，陈珍珍，陶 春，宋洪涛 （. 福建医科大学福总临床医学院 / 第九〇〇医院药学科，福建福州，350025；2. 福建医科大学药学院，福建 福州，35008）

西罗莫司（sirolimus，SRL），又称雷帕霉素，是第三代免疫抑制剂，在临床上常用于抑制肝、肾等器官移植后的免疫排斥反应。SRL 属于生物药剂学分类Ⅱ类药物，在水中的溶解度极低，而渗透性良好[1-4]。SRL 药理活性高，但因水溶性差，且易被肠壁和肝中的CYP3A4 同工酶广泛代谢，致使其口服生物利用度较低。这是临床应用SRL 的重要缺陷之一。目前，已上市的SRL 制剂主要是纳米结晶片，生物利用度约为17%[5-7]。

通过适当的制剂技术提高SRL 在胃肠道中的溶解度，可提高其口服生物利用度。在前期研究中，课题组分别独立进行了含SRL 的自微乳（selfmicroemulsifying drug delivery system，SMEDDS）、固体分散体（solid dispersion，SD）和纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）的构建，均显著改善了SRL 的体外溶出。本实验在前期研究的基础上，新增环糊精衍生物对SRL 的增溶研究，结合体外溶出度和体内生物利用度，综合分析和评价各增溶制剂的优势和缺陷，从而为解决口服难溶性药物的研究提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Starter 2C 型pH 计(上海奥豪斯仪器公司)；RCZ-6BZ 型药物溶出仪(上海黄海药检仪器公司)；真空冷冻干燥箱(北京博医康试验仪器公司)；NS1001L2K 高压匀质机(意大利NiroSoavi 公司)；UV-2800AH 型紫外可见分光光度仪(上海优尼科仪器有限公司)；液相色谱-质谱联用仪(美国ABSCIEX 有限公司)。

1.2 试剂

SRL 对照品(含量99.9%)、SRL 原料药(含量99.6%)，购自福建科瑞药业有限公司；子囊霉素对照品(上海齐奥化工科技有限公司)，Rapamune®(美国惠氏制药)。聚乙二醇6000(PEG 6000）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）均购自国药集团化学试剂有限公司；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer 188)、聚氧乙烯35 蓖麻油(Cremophor EL）、聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor RH40）均购自德国BASF 公司； 油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M1944CS)、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、棕榈酸硬脂酸甘油酯(Precirol ATO5)、月桂酸聚乙二醇甘油酯(Gelucire 44/14)均购自法国GATTEFOSSE 公司；HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD(山东滨州智源生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 SRL 含量测定方法

采用高效液相色谱仪（HPLC）测定样品中的SRL 含量[8]。色谱柱为Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-水（45∶34∶21），流速为1 ml/min，检测波长为278 nm，柱温为50 ℃，进样量为20 μl。配制浓度为2、4、8、12、16、20 μg/ml 的SRL 对照品溶液，得标准曲线为Y=54.712X+1.221，r=0.999 9，表明在2～20 μg/ml 浓度范围内线性关系良好。另外，精密度、回收率符合要求。

2.2 SRL 增溶方法

2.2.1 SRL-SMEDDS 的制备

参考前期研究[9]，称取1 g SRL 原料药，加入19 g 的助乳化剂Transcutol HP，超声至全部溶解后，加入22 g 油相Labrafil M1944CS 及39 g 乳化剂Cremophor EL，涡旋混匀，得到淡黄色澄清溶液，即SRL-SMEDDS。

2.2.2 SRL-NLC 的制备

参考前期研究[10-11]，取Gelucire44/14 和Crodamol GTCC 在75 ℃水浴中完全熔融后，加入SRL 原料药搅拌均匀成澄明油相，再将同温度吐温-80 的水溶液迅速倒入油相，以300 r/min 搅拌30 min 制备初乳，再经高压匀质机90 MPa 乳匀5 次，即得SRL-NLC 分散液，其中SRL 为0.21%，Gelucire44/14:Crodamol GTCC（1∶2.1），脂质总量为10%，吐温-80 为7.33%。随后，将SRL-NLC（42.6%）加入微晶纤维素和聚乙烯吡咯烷酮（50%，4∶1）中，研磨混合并放置过夜以充分吸附，加入甘露醇（冻干保护剂，3%），经冷冻干燥过夜后，所得固体粉末中加入低取代羟丙基纤维素（崩解剂，4%）和二氧化硅（助流剂，0.4%）即得固化纳米脂质体。

2.2.3 SRL-SD 的制备

采用溶剂-熔融法制备SRL-SD。称取载体材料，于80 ℃水浴加热熔融，滴入SRL 乙醇溶液，充分混匀，待乙醇挥发完全后，迅速将其倾倒于冰浴条件下的不锈钢板上成薄膜，固化，再于-18 ℃放置4 h后，将固体分散体从不锈钢板上刮下，置真空干燥器中干燥，待脆化后研细，过80 目筛，即得SRL-SD。以载体种类、药物-载体比例为考察因素，以0.4%SDS 中的溶出度为指标，对SRL-SD 进行单因素分析。

2.2.4 SRL-IC 的制备

称取适量β-环糊精衍生物溶于去离子水中，缓慢滴加SRL 乙醇溶液，在一定温度下磁力搅拌至澄清透明，减压挥发4 h，使乙醇挥发完全，再置于4 ℃冰箱冷藏12 h，降低SRL 的溶解度，从而使游离的SRL 发生结晶。经0.22 μm 微孔滤膜过滤除去结晶，滤液冷冻干燥24 h，所得固体研磨细化，过80 目筛，即得SRL-IC。

称取一定量的SRL-IC 置10 ml 容量瓶中，加入50%甲醇水溶液，超声至全部溶解后，定容至刻度，并采用HPLC 测定SRL 含量，根据公式：包封率（%）=[（SRL 投入量-SRL 测定量）/ SRL 投入量]×100%，进行计算。以环糊精衍生物的种类、浓度、温度、乙醇体积和投药量为考察因素，以包封率为指标，对SRL-IC 进行单因素分析。

2.3 体外溶出试验

参考《中国药典》2015 年版四部通则0931 项下溶出度与释放度测定法，考察SRL 原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRLIC 及SRL-SD 的溶出曲线。除市售片外，其余样品均装入硬胶囊中，每个胶囊含1 mg SRL。采用桨法，搅拌速度为100 r/min，溶出介质体积为250 ml，分别以0.4% SDS、水、pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液、pH 6.8 磷酸盐缓冲液、pH 7.4 磷酸盐缓冲液为溶出介质。将两颗胶囊或药片置于沉降篮中，投入溶出介质，在10、30、45、60、90、120 min，吸取2 ml 介质，并补充等温等体积的介质，采用HPLC 测定样品中的药物含量，绘制溶出曲线。

2.4 体内药代动力学试验

选用比格犬为实验动物，采用6 周期6 交叉实验设计，进行SRL 原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC 及SRL-SD 的药代动力学试验。给药剂量为1 mg SRL，实验动物试验开始前12 h 禁食不禁水，给药4 h 后自由饮水，2 次给药间隔2 周以上的清洗期。于给药前，0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 及72 h 分别经前肢小静脉采血2 ml，置于含肝素和EDTA 的抗凝管中，-20 ℃保存备用。血样处理与测定方法参照课题组前期研究[12]。

3 结果

3.1 SRL-SD 的制备

3.1.1 载体种类

如图1A 所示，不同载体材料制备的SRLSD 的溶出曲线显示了明显的差异，溶出速率为PEG6000＞F68＞PVP K30＞HPMC606＞HPMC-ASMF。同时，各载体材料的溶出度均不理想（≤50%），因此进一步考察采用二元载体制备SRLSD。

选择PEG6000 联合F68 制备二元载体固体分散体[13]，两者比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。随PEG6000/F68 比例的增大，则SRL 溶出度呈增大趋势，在PEG6000/F68 为2∶1 时的溶出度达到最大（图1B）。

3.1.2 药物-载体比例

在PEG6000/F68=2∶1 的基础上，进一步考察药物-载体比例对SRL-SD 溶出的影响。药物-PEG6000/F68 载 体 比 例 为1∶2∶1、1∶4∶2 及1∶6∶3 所制的SRL-SD 的溶出曲线相似，没有明显差别，2 h 的溶出度都接近100%（图1C）。因此优选载药量最大，即药物- PEG6000/F68 载体比例为1∶2∶1。

3.2 SRL-IC 的制备

3.2.1 β-环糊精衍生物种类

在其他条件相同的情况下，HP-β-CD、SBE-β-CD 和DM-β-CD 对SRL 的包封率分别为（11.21±3.35）%、（8.24±3.11）%和（31.86±3.26）%，见图2A。因此，优选DM-β-CD 制备SRL-IC。

3.2.2 温度

采用DM-β-CD 制备SRL-IC，考察不同温度对包封率的影响。结果显示（图2B），温度越低，包封率越高，10 ℃条件下制备的SRL-IC 的包封率显著高于30 ℃和50 ℃（P＜0.01），为（58.61±4.16）%。因此，优选10 ℃制备SRL-IC。

3.2.3 环糊精衍生物浓度

DM-β-CD 的浓度由200 mg/ml 增大至300 mg/ml，SRL 的包封率由（52.12±4.17）%增大至（58.61±4.11）%（P＜0.05，图2C）。进一步增大DM-β-CD 的浓度至600 mg/ml，包封率没有明显变化（P＞0.05）。因此，优选DM-β-CD 的浓度为300 mg/ml 制备SRL-IC。

3.2.4 乙醇体积

乙醇体积由0.5 ml 增大至2 ml，包封率呈增大趋势（图2D）。因此，优选乙醇体积为0.5 ml 制备SRL-IC。

3.2.5 投药量

SRL 的投药量6 mg 增大至8 mg，包封率显著降低，6 mg SRL 的包封率为（95.21±1.10）%，见图2E。因此，优选SRL 的投药量为6 mg。

3.3 体外溶出度

考察SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS 及SRLNLC 在不同介质中的溶出曲线。如图3 所示，在0.4% SDS 中，各制剂在2 h 的溶出度均超过80%，尤其是SMEDDS 和NLC 的溶出度接近100%。

在pH 6.8 和水中，SRL-SD 的溶出速率减小，2 h的溶出度分别为（65.00±4.90）%和（76.70±1.95）%。在pH 4.5 和pH 7.4 的介质中，SRL-SD 的溶出在1 h达到最大值，分别为（53.20±4.34）%和（55.20±4.34）%，随后溶出度逐渐降低。在pH 1.2 的介质中，未检测到SRL。

在水、pH 4.5、pH 6.8 和pH 7.4 中，SRL-IC 在40 min 内的溶出速率有所减小，但2 h 的累积溶出没有明显变化，均在80%以上。在pH 1.2 的介质中，SRL-IC 的溶出度在30 min 达到最大值，为（49.84±7.21）%，随后溶出度逐渐降低。

SRL-SMEDDS 和SRL-NLC 显示了与SRL-SD相似的溶出趋势，即在水和pH 6.8 中的溶出度低于0.4% SDS，但大于80%。在pH 4.5 和pH 7.4 的介质中，溶出达到峰值（约80%）后逐渐降低。

3.4 比格犬体内药动学试验

SRL 血药浓度-时间曲线见图4，经DAS 3.2.6 软件处理后，具体参数见表 1。

以原料药为参比制剂，SRL-SD、SRL-IC、SRLSMEDDS、SRL-NLC、Rapamune®的相对生物利用度分别为332.8%、522.9%、1 228.6%、1 537.1%、1 574.3%，表明各增溶方法都显著提高了SRL 的生物利用度。

以市售纳米晶片Rapamune®为参比制剂，SRLSD、SRL-IC、SRL-NLC、SRL-SMEDDS 的相对生物利用度分别为18.7%、33.2%、78.0%、97.6%，可见在各增溶方法中，SMEDDS 对SRL 体内吸收的作用最显著，与市售制剂相当。

4 讨论

表1 非房室模型体内药动学参数（ ±s）

表1 非房室模型体内药动学参数（ ±s）

参数 SRL SRL-SD SRL-IC SRL- NLC SRL-SMEDDS Rapamune®AUC0→72(μg·h/ml) 0.70±0.13 2.06±0.79 3.66±2.64 8.60±2.03 10.76±1.57 11.02±2.73 AUC0→t(μg·h/ml) 0.73±0.15 2.07±0.81 3.78±2.84 8.67±1.95 11.15±2.11 11.75±3.13 t1/2 (t/h) 16.53±1.50 14.50±2.15 20.64±5.45 8.97±6.87 12.97±5.67 14.54±5.67 tmax(t/h) 1.04±0.25 1.25±0.28 1.04±0.25 1.13±0.31 1.50±0.38 1.83±0.26 cmax (ng/ml) 0.16±0.05 0.36±0.05 0.53±0.13 0.90±0.09 1.23±0.07 1.28±0.13

本研究同时制备和比较了SRL 的4 种增溶制剂，均显示了良好的体外溶出度。同时，各制剂都提高了SRL 的生物利用度，但体内吸收程度有较明显的差异。

首先，SRL 本身的性质是影响体内吸收的重要因素。在理化性质方面，SRL 在电解质溶液中可发生开环水解，特别是在强酸和碱性条件下，降解速率显著增加[14]。在生理因素方面，SRL 是肠道内CYP3A4 酶和P 糖蛋白的底物，对肠道吸收有较大影响[15]。

其次，制剂本身的特点对体内吸收有重要影响。SMEDDS 和NLC 均可形成纳米级的脂质微粒，在胃肠道消化后可形成乳糜胶束[16-17]均减轻了胃肠液的pH 对SRL 的降解作用，因此SMEDDS和NLC 对脂质微粒中的SRL 有一定的保护作用。相比之下，SD 中的SRL 快速释放后，载体材料失去了对药物的隔离保护作用，导致SRL 在极短的时间内发生降解。另外，环糊精的空腔可以容纳药物分子[18]，不仅提高了SRL 的溶解度，而且降低了H+和OH-对SRL 的作用概率，减缓了SRL 的降解。本研究的体外溶出试验也证实了不同增溶制剂中SRL 稳定性的差异。

同时，SMEDDS 的辅料Labrafil M1944 CS 和Cremophor EL[9,19-21]和NLC 中的脂质及其代谢产物能够抑制CYP3A4 酶的代谢和P 糖蛋白外排，消化后形成的乳糜胶束还可通过淋巴途径吸收[22]，从而提高了生物利用度[10-11]。

另外，由于SRL 分子量较大，分子结构可能仅有部分插入环糊精的空腔中。因此，尽管环糊精提高了SRL 的溶出度，但包合物的稳定性较差，进入胃肠道后，药物可被胃肠液中的成分替换[23]，导致SRL 加速降解或发生重结晶，进而生物利用度下降。