红色诺卡菌细胞壁骨架中化学成分的鉴别与单糖含量测定

万 众，于 丹，王 菲，李 伟，张 海 （. 上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科，上海 00080；. 山东中医药大学药学院，山东 济南 5055；. 同济大学附属第一妇婴保健院药剂科，上海 004）

红色诺卡菌（Nocardia rubra，Nr）是一种放线菌， 其 细 胞 壁 骨 架（Nocardia rubracell wall skeleton，Nr-CWS）具有免疫调节作用[1]。Nr-CWS作为一种治疗药物现已在国内上市并在临床使用。研究表明，Nr-CWS 在增强体内巨噬细胞、T 细胞和自然杀伤细胞活性的同时，还能诱导机体产生LAK 细胞，提高机体内T 辅助性细胞和杀伤细胞活力、增强巨噬细胞和天然杀伤细胞免疫活性，抑制肿瘤和增强免疫能力的功效[2-4]。但Nr-CWS 在发挥作用的同时，往往还伴随一些副作用的发生。究其主要原因是由于红色诺卡菌细胞壁是个细胞粗提物[5]，其中的成分复杂，具体哪种成分起相应的药理作用还不清楚，这极大地影响了其临床使用及后续药理作用机制的研究。本研究拟采用UHPLC-Q-TOF/MS 分析方法首先对Nr-CWS 提取物中化学成分进行分离分析，鉴别其中的化学成分；并对其中的多糖成分进行水解，然后对水解后的单糖进行衍生化处理，与其他分析方法相比, UHPLC-MS/MS 具有较大的优越性[6-8],其灵敏度高、专属性强、可以快速准确地测定单糖的含量。所以本研究采用UHPLC-MS/MS 方法对单糖衍生化产物进行定量分析测定，这将为后期开展Nr-CWS 活性成分筛选及药理作用机制的研究奠定基础。

1 材料

1.1 实验仪器

安捷伦-1 290 Infinity 高效液相色谱系统-电喷雾离子源（安捷伦，Palo Alto, CA, USA）串联安捷伦6 538 四级杆-高分辨飞行时间质谱（UHPLC-QTOF/MS），安捷伦-1 290 Infinity 高效液相色谱系统-电喷雾离子源（安捷伦，Palo Alto, CA, USA）串联安捷伦6 460 三重四级杆质谱（ UHPLCMS/MS），AMIDE 色谱柱（3.0 mm×100 mm，3.5 μm，Waters，USA），Waters Xbridge C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Milli-Q50 SP 纯水制备系统制备（Millipore Corporation, MA, USA），电热干燥箱（上海恒科仪器有限公司，DHG-9145AZ）。

1.2 材料与试剂

Nr-CWS 提取物（辽宁格瑞士特生物科技有限公司，按照产品工艺提取）；Sephadex G-100（国药集团化学试剂有限公司）；D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖（纯度＞98%，国药集团化学试剂有限公司）；三氟乙酸(TFA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，国药集团化学试剂有限公司）；HPLC 色谱级甲醇、乙腈（默克公司，Darmstadt, Germany）；乙醇、甲酸（Fluka 公司，Buchs, Switzerland）。

2 方法与结果

2.1 Nr-CWS 提取物中化学成分分析与鉴别

2.1.1 UHPLC-Q-TOF/MS 成分分析与鉴别的条件

UHPLC-Q-TOF/MS 分 析 在 安 捷 伦 1 290 Infinity 液相色谱系统和安捷伦6 538 四极杆-高分辨飞行时间串联质谱仪(Agilent，USA)上进行，色谱分离在Amide 色谱柱上进行（3.0 mm×100 mm，3.5 μm，Waters，USA），柱温40 ℃，流动相A 为0.1 %甲酸水溶液，流动相B 为乙腈溶液，流速0.4 ml/min，流动相采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～1 min，5 %A；1～5 min，5 %～20 % A；5～20 min，20%～45 % A；20～30 min，45 % A，进样量为5 μl，自动进样器温度保持在25 ℃。电喷雾离子源（ESI）采用正、负离子模型。Q-TOF/MS 质谱参数如下：毛细管电压，正离子模式下4 kV，负离子模式下3.5 kV；干燥器流速11 L/min；气体温度350 ℃；雾化器压力45 psig；碎片电压120 eV；Skimmer 电压60 eV。质谱的采集范围m/z50～1 100，分析碰撞能量10～40 eV。

2.1.2 Nr-CWS 提取物样品溶液的制备

取Nr-CWS 提取物溶于1 ml 纯水中，充分涡旋溶解后制成Nr-CWS 提取物母液，取100 μl 于1.5 ml EP 管中，加入3 倍量的乙醇进行蛋白沉淀。然后4 ℃下13 000 r/min 离心15 min，吸取200 μl上清液，于进样瓶中用于UHPLC-Q-TOF/MS 分析。

2.1.3 Nr-CWS 提取物中化学成分的分析与鉴别

采用UHPLC-Q-TOF/MS 分析方法对Nr-CWS提取物样品溶液进行快速地分离与分析，获得正、负离子模式下的总离子流图，通过与Metlin 数据库中代谢物信息比对分析，可对Nr-CWS 提取物中化学成分进行快速分析与鉴别，结果如图1 和表1 所示。

2.2 Nr-CWS 提取物中单糖成分的含量测定

2.2.1 单糖标准溶液的制备

准确称取D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖各10 mg，分别置10 ml 容量瓶，各加水定容，即得1 mg/ml浓度的各单糖标准品溶液。分别精密取上述单糖标准品溶液，混合后加重蒸水稀释，制成100 μg/ml的单糖混合标准溶液。

2.2.2 衍生化试剂的制备[9-12]

精密称取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)1.0 g，置10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制得0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液。

2.2.3 单糖衍生化前处理方法[13-14]

精密吸取单糖及混合标准品溶液100 μl 置2 ml EP 管中，添加100 μl 氨水，再加入100 μl 0.5 mol/L的PMP 甲醇溶液，涡旋30～45 s，于70 ℃烘箱中加热30 min，取出放冷至室温。加入100 μl 乙酸，涡旋30 s 中和，加重蒸水至1 ml，再加500 μl 氯仿，涡旋30 s，混匀，弃去下层溶液，重复3 次，12 000 r/min离心10 min，水层经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取次滤液用于UHPLC-MS/MS 分析，见表2。

表1 Nr-CWS 中化学分析的UHPLC-Q-TOF/MS 数据信息

2.2.4 单糖衍生物的UHPLC-MS/MS 分析条件

UHPLC-MS/MS 分析采用安捷伦1 290 Infinity液相色谱系统和安捷伦6 460 三重四极杆串联质谱仪(Agilent，USA)。色谱分离在Waters Xbridge C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，流动相A 为20 mmol/L 的乙酸铵水溶液（氨水调pH 8.0），流动相B 为乙腈溶液，流速0.4 ml/min，流动相采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～2 min，15%～20% B； 2～4 min， 20%～25% B； 4～5 min，25%～95 % B，5～6 min，15 % B，样品分析时间5 min，柱后平衡时间1 min。进样量为2 μl，自动进样器温度保持25 ℃。三重四级杆质谱条件为：电喷雾离子源（ESI）采用负离子，多级反应选择离子监测模式：毛细管电压3.5 kV；干燥器流速11 L/min；气体温度350 ℃；雾化器压力40 psig；碎片电压80 eV；Skimmer 电压60 eV。

2.2.5 Nr-CWS 提取物中多糖的水解

精密吸取Nr-CWS 提取物溶液1 ml，加入2 mol/L的TFA 2.0 ml，放入110 ℃的真空干燥箱中，酸性条件下水解6 h，冷却至室温，4 ℃条件下离心干燥，挥发三氟乙酸，加重蒸水1 ml 复溶，用于衍生化处理。

2.2.6 Nr-CWS 提取物中单糖成分衍生化样品的制备和UHPLC-MS/MS 的含量测定

精密吸取Nr-CWS 提取物的水解液100 μl，按照前述单糖衍生化方法进行前处理后，精密吸取前处理后的样品溶液2 μl 进UHPLC-MS/MS 分析，混合标准品和Nr-CWS 样品衍生化后的UHPLCMS/MS 色谱图见图2。

2.2.7 单糖分析的标准曲线和定量限、检测限

精密吸取单糖混合标准品溶液，按前述单糖衍生化方法进行前处理后，精密吸取前处理后的样品溶液2 μl 用UHPLC-MS/MS 法分析，以各单糖峰面积与相应浓度进行线性回归分析，计算回归方程和相关系数，逐步稀释后，按照信噪比S/N=10 和3，分别计算其定量限和检测限，结果见表3。

2.2.8 精密度试验

取经水解和衍生化反应后的单糖混合标准溶液，按照前述UHPLC-MS/MS 分析测定条件，连续进样6 次，计算其测定结果的RSD 为3.13%，结果表明该方法的精密度良好，符合分析测定的要求。

2.2.9 单糖衍生化样品的稳定性试验

Nr-CWS 提取物溶液经水解和衍生化反应后，室温下放置，分别于0、5、l5、30、60、120 min 进样，进行UHPLC-MS/MS 分析，测定其浓度，对样品的稳定性进行评价，结果6 次测定结果的RSD 为7.63%，表明样品在2 h 内稳定性良好，符合分析测定的要求。

2.2.10 重复性试验

取同一批样品，重复测定6 次，计算其测定结果RSD 为4.67%，表明该方法的重复性良好，符合分析测定的要求。

2.2.11 回收率试验

精密吸取已知含量的Nr-CWS 提取物加入接近等量的单糖混合标准品溶液，经水解和衍生化反应后，进行UHPLC-MS/MS 分析，计算其平均回收率为86.93%，RSD 为9.15%，符合分析测定的要求。

表3 单糖衍生物的标准曲线及定量限和检测限

2.2.12 单糖含量测定

精密吸取Nr-CWS 提取物样品溶液6 份，经水解衍生化后，按照前述UHPLC-MS/MS 分析条件对衍生化后的样品进行分离分析，测定其中单糖的含量，结果见表4，可以看出8 种单糖成分都能被检出，其中阿拉伯糖和半乳糖的含量最高。

表4 Nr-CWS 提取物（1～6）中8 种单糖成分的含量测定结果

3 讨论

Nr-CWS 提取物中化学成分的分析鉴别，采用UHPLC-Q-TOF/MS 分析方法对Nr-CWS 提取物样品溶液进行快速地分离分析[15-16]，获得正、负离子模式下的总离子流图，通过与Metlin 数据库中代谢物信息快速地比对分析，共鉴别出Nr-CWS 提取物中64 个化学成分，其中包含氨基酸、脂肪酸、单糖、胞壁酸、粘肽等成分，说明Nr-CWS 提取物中含有很多的细胞代谢产物，且以氨基酸、脂肪酸和糖类成分为主，这些成分就是Nr-CWS 提取物发挥作用的主要成分。

由于Nr-CWS 提取物中成分复杂，采用UHPLCQ-TOF/MS 方法直接对提取物进行分析，仅能检测到个别单糖成分，如木糖、半乳糖、葡萄糖等，说明Nr-CWS 提取物中主要含有多糖成分，经水解衍生化后[17-20]，采用UHPLC-MS/MS 方法进行检测，8 个单糖都能被检测到，且阿拉伯糖和半乳糖的含量最高，说明Nr-CWS 中的多糖主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，这将为进一步的多糖成分分析鉴别奠定基础。

对单糖进行分析测定的方法有很多，我们通过比较衍生化和不衍生化方法的检测限和定量限，发现单糖衍生化后，其定量限和检测限更低，测定干扰更少，分析方法学验证结果表明，其精密度、重现性、稳定性和回收率均符合分析测定的要求。

4 结论

本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS 方法对Nr-CWS 提取物中化学成分进行了快速地分离与分析，通过与Metlin 代谢物成分数据库比对，共鉴别出Nr-CWS 提取物中64 个化学成分，主要包括氨基酸、糖类、脂肪酸等成分；对Nr-CWS 提取物中糖类成分衍生化后，采用UHPLC-MS/MS 分析方法对Nr-CWS 提取物中8 种单糖成分进行含量测定。结果表明，Nr-CWS 中阿拉伯糖的含量最高，其次为半乳糖，说明Nr-CWS 中发挥作用的主要多糖类成分可能主要由这几种单糖组成。通过本研究为后期开展Nr-CWS 活性成分筛选及药理作用机制的研究奠定了基础。