鲢鳙引入对于稻虾综合种养水体微生物多样性的影响研究

赵黎明， 吕 瑛， 李旭东， 付勇浩， 王乐平

（1.河南省水产技术推广站， 郑州450000； 2.驻马店市农业农村局， 河南驻马店463000；3.罗山县水产局， 河南信阳464200）

1 前言

随着人们的生活水平提高和对生活娱乐社交的需要，小龙虾因其味道鲜美、营养价值高，备受人们青睐[1]。随着近年来种养结合的水产生产方式在全国范围内得到推广，稻虾综合种养的面积逐年上升[2]，不仅优化了种养模式，还给农户带来了经济效益[3]。近年来，稻虾养殖越来越受到稻田环境恶化、蓝藻和青苔暴发、五月瘟疫等的影响，多营养级综合种养是近年来随着稻田综合种养被提出的一个发展方向，通过丰富稻田中的养殖品种，在稻田内形成不同营养层次物种的立体综合养殖，从而有效提高饵料利用率、减少养殖有害物质积累，最终实现绿色安全种养的一种新型养殖模式。

微生物在养殖水环境中起着重要的作用[4]，广泛参与水体中的物质循环[5，6]，参与氨化、硝化、氧化、反硝化等作用的微生物更是与养殖的成败息息相关[7]。其在水产养殖中具有重要作用，其群落多样性研究也较多[8]。目前对于微生物单纯的培养分离方法已经不能满足研究的需求，逐渐被高通量测序技术为基础的微生物多样性分析方法所替代；近年来，基于高通量测序技术的DNA宏条形码技术在微生物群落多样性研究中被广泛应用[9]。

为了优化稻虾综合种养环境，提升养殖成功率，我们利用多营养级综合种养的原理，在稻虾综合种养模式下，增加滤食性鱼类鲢、鳙，形成新型多营养级稻虾综合种养模式。本研究中，我们利用二代测序技术，对不同模式下稻田水体微生物多样性开展比较研究，以期了解鲢鳙的引入对于稻田养殖系统的影响。

2 实验材料与方法

2.1 模式对比实验设计

2019年5～9月，在河南省信阳市罗山县庙仙乡设置试验田10块，每块试验田的面积为160 m2。其中1、2、3试验田为稻虾共作，4、5、6、7试验田为稻虾鱼（鲢、鳙）共作，8、9、10试验田是水稻种植。水稻之间的株距为30cm，沟深为0.8m，水中稻田水位高15 cm，环沟内种植伊乐藻。为了防止小龙虾在稻田内逃逸，在每块稻田之间增加防逃措施，田埂四周用塑料网布建防逃墙，下部埋入土中20cm，上部高出田埂0.6 m，每隔1.5 m用木桩或竹竿支撑固定，网布上部内侧缝上宽度为30 ㎝左右的塑料膜形成倒挂，以防小龙虾逃逸[10]。

2019年5月15日种植水稻，9月20号进行收割。水稻栽种后进行施肥，每块试验田用5 kg菜籽饼和2.5 kg复合肥，在养殖期间不得在池塘中施肥或者喷洒各种农药。水稻栽种一周后在1～7号试验田中放入小龙虾苗，放养的规格为100只/kg，投放密度按照7.5万尾/hm2。在3-7号试验田放入鲢、鳙，每个田块放入100 g的鲢、鳙鱼种各10尾；小龙虾放养后及时投喂饲料。在6月15日之前每天傍晚投喂1次，按体重的2%进行投喂，6月15日之后每天投喂2次，按体重的2%进行投喂。在种养殖期间，10个试验田的日常管理必须保持一致，包括每日饲料的投喂量，注水量等。

2.2 样品的收集和总DNA的提取

在养殖后期2019年8月30日对试验田水样进行采集。使用0.22 μm微孔滤膜对水样进行过滤，收集水体中的微生物，低温冷藏保存。上述滤膜样品剪碎，将其在研钵中用液氮磨至粉状，使用CTAB法对总DNA进行抽提，将得到的DNA置于-20 ℃保存备用。

2.3 16s rDNA序列扩增

1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的DNA质量，利用定量检测试剂盒(型号Qubit2.0 DNA)对基因组DNA进行精确定量，根据检测结果确定PCR反应的模板DNA添加量。利用16S rRNA基因具有保守序列的特点， 用 通 用 引 物 (MSQ341F-91:CCTACAC -GACGCTCTTCCGATCTN (barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG，Miseq-805R:GACTGGATTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC)扩增16S rRNA基因的V1～V3 区。将5 μLPCR反应缓冲剂、1 μLdNTP、2 μL上游引物、2 μL下游引物、1 μL模板DNA、0.5 μLTaqDNA聚合酶、38.5 μLH2O混合均匀后离心5 s，将配置好的PCR体系进行PCR扩增，用94 ℃变性3 min，94 ℃变性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，在72 ℃下最后延伸5 min，能够让反应产物扩增充分。PCR的产物应在PCR结束后进行琼脂糖电泳检测，对扩增后得到的DNA产物纯化回收。

2.4 高通量测序

利用Miseq测序平台对扩增文库进行双末端测序，对测序得到的结果进行数据质量控制，最终得到有效数据。利用序列分析软件根据序列间的相似性对得到的数据进行比对注释，后续生物信息统计采用97%相似度水平(属水平) 下得到的操作单元（OTU）进行分析，将序列分成不同的OTU。

2.5 生物学数据分析

对不同实验组的样品OTU序列进行鉴定，获取物种的信息。分析各个样品中的优势种群及其组成情况，进行比较。对物种的多样性进行测定。采用香农指数（Shannon index）来估算样品中微生物群落多样性。各样品微生物组成用柱状图表示，可以看到不同样品中不同微生物所占有的百分比。使用SPSS 18.0对微生物群落结构进行主成分PCA分析，得到因子得分数并进行PCA散点图绘制。

3 结果

3.1 高通量测序基本情况

通过总DNA提取、PCR检测各样品中微生物的DNA，对实验组内微生物多样性展开测序，序列数据经过质控和过滤得到有效数据，得到有效数据共计409879 条。

3.2 多样性分析

通过对样品Alpha多样性分析，可以反映该区域内微生物群落的丰富度和多样性。丰富度由群落中OTU数目可以反映出来。从图1可以看出不同稻田综合种养模式下微生物的丰富度无明显规律，并没有因为稻田内养殖物种的不同产生明显的变化。群落的多样性可由香农指数来反映。稻虾养殖的微生物群落多样性要高于其他两个模式下的试验田（如图1）。

3.3 物种的组成和优势类群分析

数据分析得到的OTU可以归入到伯克氏菌目（Burkholderiales）、甲基球菌目（Methylococcales）、红环菌目（Rhodocyclales）、鞘脂杆菌目（Sphingobacteriales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、嗜甲基目（Methylophilales）、奈瑟氏菌目（Neisseriales）、放线菌目（Actinomycetales）、黄杆菌目（Flavobacteriales）、噬纤维菌目（Cytophagales）、红螺菌目（Rhodospirillales）。伯克氏菌目、鞘氨醇杆菌目、放线菌目、黄杆菌目是所有样品中的优势种。

3.4 群落结构分析

对样品数据进行主成分分析，得出分析图（图2）。群落分析的PCA图显示各微生物群落按照种类模式较好的聚类在一起。

4 讨论

从香农生物多样性指数分析表明稻虾共作微生物多样性较高，而水稻单作和稻虾鱼共作模式下水体微生物群落多样性较低。这可能是由于相比于水稻单作，小龙虾的爬行扰动、摄食等行为，可能促进了环境中微生物的多样性上升，而鲢、鳙混养后，系统内部的营养循环进一步得到优化，而碳源的总量降低，因此为微生物多样性受到了限制。三组试验模式下共同的优势种有4 种，分别是：伯克氏菌目（Burkholderiales）、鞘氨醇杆菌目（Sphingobacteriales）、放 线 菌 目（Actinomycetales）、黄 杆 菌 目（Flavobacteriales）。稻虾鱼共作与其他两组的主要区别优势种为噬纤维菌目（Cytophagales）和根瘤菌目（Rhizobiales）。在5#样品中未出现根瘤菌目（Rhizobiales）可能是因为在取样的过程中选择的地点和位置略有不同。从PCA分析图中可以看出，3个模式下水体微生物群落多样性具有很明显的差异，表明养殖生物的引入对于稻田水体微生物的影响较大。而稻虾鱼组和另外两个实验组的离散程度较大，说明鲢鳙的引入可以极大的改变水体微生物多样性的组成。