金刚藤对肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标的影响▲

李 凯 秦 坚 黄李平 吕军影

(1 广西医科大学第一附属医院中医科，南宁市 530021，电子邮箱：likaizhongxiyi@yeah.net；2 广西医科大学第一临床医学院，南宁市 530021)

金刚藤属于壮药，主产于广西、湖南等地区，具有祛风利湿、活血化瘀、解毒散结等功效。现代药理学研究表明，金刚藤提取物具有抑制炎症、减轻水肿、改善血液循环、调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化等药理作用[1]。金刚藤作为一种民间常用药，多用于治疗妇科炎症、风湿关节痛、 跌打损伤等病，其临床效果较为肯定[2]。临床上常将其作为活血化瘀药和补虚药，或者清热药、理气药，用于肝病的治疗[3]。但金刚藤对肝纤维化的干预效果如何，鲜见研究报告。本研究探讨金刚藤对肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只周龄6～8周的SD大鼠，雌雄各半，平均体重200 g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2014-002。

1.2 主要药品及试剂 四氯化碳分析纯购自天津市化学试剂公司，将四氯化碳与花生油(鲁花牌)按4 ∶6的比例调制成浓度为40% 四氯化碳花生油混合液备用。金刚藤干燥厚片购于广西医药公司(批号：14392014003)。总胆红素、白蛋白、ALT、AST试剂盒由北京生物技术研究所提供(批号：JLC1728、JLC1586、JLC1033、JLC1905)。透明质酸、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型胶原和Ⅲ型前胶原(procollagen type Ⅲ，PCⅢ)试剂盒由北京生物技术研究所提供(批号：CK-E30401R、CK-E30645R、CK-E91483R、CK-E30178R)。

1.3 分组及动物模型的制作 将50只SD大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法将其分为正常对照组、模型对照组、金刚藤低剂量组、中剂量组、高剂量组。除正常对照组外，其余4组大鼠参照文献[4]制作动物模型：第1周按5 mL/kg腹腔注射40% 四氯化碳混合液1次；第2周开始按3 mL/kg腹腔注射40% 四氯化碳混合液，每周2次，共6周；第8周开始，按3 mL/kg腹腔注射40%四氯化碳混合液，每周1次，共4周。5组大鼠均给予普通饲料喂养和饮用自来水。

1.4 金刚藤水煎剂的制备 金刚藤水煎剂由广西医科大学药理实验室制备：将200 g金刚藤浸泡20～30 min，水浸过药面约2 cm，武火(1 800 W)煮沸后改用文火(600 W)煎30 min，冷却30 min后滤渣取汁；药渣按上述步骤再煎煮2次，分别取汁，将每次获得的药液混合，用文火煮浓缩至100 mL左右，配制成2 g/mL金刚藤水煎剂，置4℃冰箱中保存备用。

1.5 给药方法 根据成人每日金刚藤用量为20 g，按照人鼠体表面积换算法给药，计算方法如下：(20÷60)×6.25×0.25=0.5g。将该常规药量设为中剂量，低剂量为0.25g,高剂量为1 g，即分别为2 g/(kg·d)、1 g/(kg·d)、4 g/(kg·d)的2 g/mL金刚藤水煎液，体积分别为0.25 mL、0.1 mL、0.5 mL。建模第8周开始，金刚藤低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃相应剂量的金刚藤水煎液，正常对照组、模型对照组给予10 mL/kg的生理盐水灌胃，均1次/d，给药4周。

1.6 观察指标

1.6.1 标本采集：末次灌胃后，大鼠禁食，不禁水，12 h后以10%水合氯醛麻醉大鼠,心脏采血，3 500 r/min离心10 min后，取上清液,置于4个EP管中，将EP管置于-80℃冰箱保存待检。

1.6.2 指标检测：采用赖氏法检测ALT、AST、白蛋白、总胆红素水平；采用酶联免疫吸纳法检测透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 5组大鼠血清ALT、AST、ALB、TBIL水平的比较 与正常对照组比较，模型对照组ALT、AST、总胆红素水平升高，白蛋白水平下降(均P<0.05)。模型对照组、金刚藤低、中、高剂量组ALT、AST、总胆红素水平依次降低，白蛋白水平依次升高(均P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血清ALT、AST、ALB、TBIL水平的比较(x±s)

2.2 5组大鼠血清透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平的比较 与正常对照组比较，模型对照组透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平均升高(均P<0.05)。模型对照组、金刚藤低、中、高剂量组透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平依次降低(均P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠血清透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原的比较(x±s，ng/mL)

3 讨 论

病毒、毒性物质、免疫系统紊乱、寄生虫感染、过量饮酒等均可导致肝脏损伤，如损伤得不到及时修复则可诱发肝纤维化。肝纤维化过程是慢性肝损伤的修复反应，表现为细胞外基质的过度沉积[5]，而肝纤维化是肝炎发展为肝硬化的中心环节。肝纤维化发生的关键环节是肝星状细胞的增生和激活，活化的肝星状细胞合成大量细胞外基质并沉积，最终导致肝纤维化形成。

ALT主要存在肝细胞内，各种肝炎均可导致ALT水平升高；而肝脏细胞坏死时，线粒体中的AST溢出也可导致血清AST水平升高。因此血清ALT、AST水平可反映肝脏损伤情况。肝脏损伤发展至一定程度后，其代谢能力下降，导致白蛋白降低，并引起总胆红素水平升高。本研究结果显示，模型对照组大鼠ALT、AST、总胆红素水平高于正常对照组，而白蛋白水平低于正常对照组(均P<0.05)，提示四氯化碳成功诱导大鼠肝细胞损伤。

研究显示，血清透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平可以用于评估细胞外基质的平衡与降解的动态过程[6]。其中，透明质酸是肝细胞外基质中的蛋白质多糖，其主要由肝间质成纤维细胞合成、分泌，而大部分由内皮细胞摄取和分解。当肝实质细胞受损，透明质酸出现分解障碍，即肝内间质细胞增生，肝血流受阻使肝窦内皮细胞摄取和分解透明质酸减少；而当发生肝纤维化时，肝星状细胞合成大量的透明质酸，但机体清除透明质酸能力下降，造成血清透明质酸升高。LN是肝细胞基底成分中的主要黏蛋白，与胶原、蛋白多糖、糖胺多糖等共同构成细胞外基质。肝纤维化时肝窦中LN过度合成而降解减少，堆积增多，导致血清LN水平升高。高水平的LN在某种程度上能够反映肝窦毛细血管化的程度和门脉区纤维化范围，与肝脏病理损伤程度密切相关[7]。PCⅢ是在细胞外形成原胶原前，被氨基端肽酶切下后进入血液循环的氨基端尾肽，与Ⅲ型胶原代谢有关。血清PCⅢ水平升高，间接提示肝脏Ⅲ型胶原合成增多。PCⅢ水平与肝纤维化程度密切相关，在肝纤维化早期其水平升高明显，晚期合成速度减慢，是肝纤维化的活动性指标之一[8]。Ⅳ型胶原是构成基底膜的主要成分，当肝细胞持续损伤时，在肝脏修复过程中，肝储脂细胞中用于合成细胞外间质的各组分增加，Ⅳ型胶原过度合成，表现为血清Ⅳ型胶原水平显著升高，从而促进肝纤维的形成。Ⅳ型胶原水平升高可反映出肝纤维化过程，是肝纤维化早期指标之一[9]。近年来，血清透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平这4项肝纤维化指标，已被认为是预测慢性肝病患者病情进展和治疗效果的指标，是评估炎症活动度、纤维化程度的重要依据。

肝纤维化是现代医学病理形态学概念，中医古籍中无肝纤维化之词，其分属“黄疸”“胁痛”“积聚”“臌胀”“肝积”等病证范畴。《金匮要略·黄疸病脉证并治》曰：“黄家所得，从湿得之”。王振常等[10]认为肝纤维化病位在肝脾肾，基本病机为本虚标实、虚实夹杂，基本病理因素有湿、热、毒、虚、痰、瘀等。正气虚弱是内因，湿热疫毒是外因，痰浊瘀血是病理产物。肝炎病毒作为肝纤维化的主要病因与中医湿热疫毒有相似之处，湿热与疫毒胶着难去则导致疾病持续存在和慢性进展。肝藏血，主疏泄，体阴而用阳，湿热疫毒缠绵难去则可损伤肝脏，导致肝脏气血失调，瘀阻脉络，因此血瘀是贯穿始终的病机关键，肝纤维化的各个证型都是在此基础上演变过来的[11]。肝纤维化基本证型为气阴虚损、瘀血阻络，根据其临床表现可分为肝胆湿热型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型，治疗原则为清热利湿、疏肝健脾、益气养阴、活血化瘀、滋养肝肾[12]。周语平等[13]研究发现，治疗肝纤维化的中药以补虚药、活血化瘀药、清热利湿药居多，且疗效较好。而目前对单味药抗肝纤维化的研究也有一定的进展，主要有丹参、三七、银杏、黄芪、苦参、半枝莲等，其抗肝纤维化有效成分多为皂苷类、黄酮类、生物碱类、氨基酸类等[14-15]。金刚藤主要化学成分有黄酮、皂苷、生物碱、氨基酸、有机酸、多糖等，研究表明金刚藤具有清热利湿、活血化瘀、解毒散结等功效[16]。而根据肝纤维化病因病机、疾病演变过程的特点，以及肝病治疗原则主要为扶正固本、疏肝解郁、活血化瘀、清热利湿，我们认为金刚藤有望用于肝病治疗。

本研究结果显示，模型对照组、金刚藤低、中、高剂量组ALT、AST、总胆红素水平依次降低，白蛋白水平依次升高(均P<0.05)。提示金刚藤水煎液可减轻肝脏炎症反应，促进白蛋白合成和提高肝脏对胆红素代谢能力，且这种作用可能呈剂量依赖性。透明质酸、Ⅳ型胶原是肝纤维化的早期诊断指标,具有比较高的敏感度,而LN是中、晚期肝纤维化的诊断指标,具有比较高的特异性,联合检测这4项指标能够比较全面反映肝纤维化程度[7]。本研究结果显示，模型对照组、金刚藤低、中、高剂量组大鼠透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平依次降低(均P<0.05)，提示金刚藤水煎液可改善大鼠肝纤维化程度，且呈剂量依赖性。

综上所述，金刚藤水煎液可以改善四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠的肝功能及纤维化程度，可能与其减轻肝脏炎症反应，促进胶原纤维降解，减少细胞外基质在肝脏中沉积有关。