传染性单核细胞增多症患儿外周血淋巴细胞亚群、细胞因子、TLRs的表达变化及其临床意义

（杭州市儿童医院 感染科，浙江 杭州 310014）

Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属于人类疱疹病毒γ 亚科嗜B淋巴细胞组群中的DNA病毒[1]，在学龄前儿童中较为常见，是引起儿童传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis,IM）最主要的病原体之一[2]。在感染潜伏期，EBV 主要是附着于B淋巴细胞中，但此时B细胞并不表达EBV 核蛋白，故不具备致病性[3]。但是当极少数记忆B细胞分化成浆细胞时，可释放出病毒颗粒，激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL），导致炎症因子大量释放，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和多种白细胞介素（Interleukin,IL）等[4]。此时EBV 从潜伏状态变为增殖状态，可引发一系列临床症状。此外，在EBV感染早期，单核细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞表面的Toll 样受体（Toll like receptors,TLRs）可识别病毒蛋白，进而启动宿主的抗病毒免疫应答[5]。炎症反应和免疫破坏协同作用可能是导致IM 预后不良的重要原因[6]。本研究旨在分析EB 感染IM患儿外周血淋巴细胞亚群、细胞因子，以及TLR7、TLR9分子的表达情况，以揭示EBV感染对儿童免疫功能的影响及IM的发病机制，为临床检测和治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2019年12月杭州市儿童医院收治的98例感染EBV致IM急性期患儿作为研究对象。其中，男性58例，女性40例；年龄13个月～13岁，平均（52.39±28.35）个月。纳入标准：①符合《儿童EB病毒相关疾病的诊断标准和治疗原则》[7]中临床诊断及实验室诊断标准；②初诊为感染EBV致IM，发病1～7 d；③EBV DNA＞1×103拷贝/ml，EBV-VCA IgM（+）或早期抗原IgG（+），且抗EBVEBNA1 IgG（-）；④1～13岁儿童；⑤配合完成治疗及相关检查，急性期与恢复期均未使用激素、免疫调节剂。排除标准：①先天性免疫缺陷或合并免疫系统疾病，既往有变态反应疾病史；②合并恶性肿瘤、血液系统疾病；③入组前3个月服用糖皮质激素、细胞毒性药物或其他免疫抑制剂。另选取同期本院体检的健康儿童50例作为对照组，血浆EBV-DNA检查为阴性。对照组男性25例，女性25例；年龄1～13岁，平均（49.36±25.78）个月。两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，患儿家属或法定监护人均签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

TG16台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），Cytomics FC500型流式细胞仪、流式试管及配套设备（美国Beckman Coulter公司），SpectraMax M3 多功能酶标仪（美国MD公司），Ficoll 单个核细胞分离液（北京索莱宝生物科技有限公司）。EBV特异性抗体试剂盒（深圳赛尔生物技术有限公司），FITC-CD3、RD1-CD4、ECD-CD8、PE-CD16+56+、APC-CD19 荧光标记单克隆抗体及同型对照抗体（美国Beckman Coulter公司），酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国R&D公司），Trizol 试剂和M-MLV 试剂盒（美国Invitrogen公司），SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒（大连宝生生物工程有限公司），核酸提取试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司）。

1.3 治疗

IM患儿入院后首先完成血常规、生化指标、肝肾功能检查。采用ELISA检测EBV 特异性抗体，予以卧床、退热、补充体液及维生素、保护脏器等综合性支持治疗，保持呼吸道畅通；必要时给予阿昔洛韦注射液（武汉普生制药有限公司，规格0.25 g/支，批准文号：国药准字H4202019）10 mg/（kg·d）抗病毒治疗，静脉注射，1次/8 h，连续治疗7 d。伴有细菌感染的患儿则给予抗生素治疗，并积极应对并发症，必要时纠正血清电解质紊乱和酸碱平衡。

1.4 检测指标

1.4.1 血液标本采集患儿治疗前（急性期）和病程满1个月复查（恢复期）时，由儿科护士分别无菌抽取患儿清晨空腹静脉血2、2和4 ml，置于肝素抗凝管、采血管、乙二胺四乙酸抗凝管中，分别用于检测外周血淋巴细胞亚群比例、血清细胞因子水平，以及收集外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）。对照组儿童采用同样的方法采集外周静脉血，收集全血和血清，保存至-80℃备用。

1.4.2 淋巴细胞亚群检测采用全血免洗法检测CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56+。

1.4.3 细胞因子检测采用ELISA 抗体双夹心法检测IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、α 干扰素（Interferon-α,IFN-α）、IFN-γ。取出试剂盒及血清标本，温度平衡至室温。使用前将所有试剂充分摇匀，严格按照操作说明书进行检测。

1.4.4 TLR7和TLR9 mRNA检测采用Ficoll 密度梯度离心法分离外周全血PBMC，采用Trizol 试剂提取PBMC的总RNA，并逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒进行qRT-PCR 反应，反应体系为20μl，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，52℃退火10 s，72℃延伸2 min，共36个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相对表达量。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.5 EBV DNA载量检测采用qRT-PCR检测全血标本EBV DNA载量。BamH1-W 正向引物：5'-GCCAGAGGTAAGTGGACTTT-3'，反向引物：5'-TACCACCTCCTCTTCTTGCT-3'，长度389 bp；荧光探针序列：5'-CACACCCAGGCACACACTACACAT-3'。根据标准曲线计算EBV-DNA载量。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差 （±s）或中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较用t检验或秩和检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析采用Spearman 法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血淋巴细胞亚群、细胞因子、TLRs mRNA比较

两组外周血淋巴细胞亚群百分比（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56+）、细胞因子水平（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-α、IFN-γ）、TLR7和TLR9 mRNA相对表达量比较，经t或秩和检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，IM组患儿急性期外周血CD3+、CD8+、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TLR7和TLR9 mRNA相对表达量升高，CD4+、CD19+、CD16+56+降低。两组血清IFN-α 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2～4。

2.2 IM患儿外周血淋巴细胞亚群、细胞因子、TLRs mRNA与EBV DNA载量的关系

经Spearman相关性分析，IM患儿急性期EBV DNA载量与血清IL-1β和TLR9 mRNA呈正相关（r=0.247和0.348，P=0.017和0.000），与其他指标无关（P＞0.05）。见图1。

2.3 急性期和恢复期患儿外周血淋巴细胞亚群、细胞因子、TLRs mRNA相对表达量比较

急性期与恢复期患儿外周血淋巴细胞亚群百分比（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56+）、细胞因子水平（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ）、TLR7和TLR9 mRNA相对表达量比较，经t或秩和检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；与急性期相比，恢复期外周血CD3+、CD8+、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TLR7和TLR9 mRNA相对表达量降低，CD4+、CD19+、CD16+56+升高。急性期与恢复期患儿血清IFN-α 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5～7。

表2 两组外周血淋巴细胞亚群比较 （%，±s）

表2 两组外周血淋巴细胞亚群比较 （%，±s）

组别 n CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD16+56+对照组 50 67.27±5.91 36.82±5.74 27.65±6.17 19.74±3.59 17.81±5.27 IM组急性期 98 82.17±5.78 17.45±5.97 55.16±10.81 6.94±3.76 7.34±3.81 t值 14.721 18.910 16.647 19.885 13.834 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 两组外周血清细胞因子水平比较 [pg/ml，M（P25，P75）]

表4 两组外周血PMBCs 中TLR7和TLR9 mRNA相对表达量比较 （±s）

表4 两组外周血PMBCs 中TLR7和TLR9 mRNA相对表达量比较 （±s）

组别 n TLR7 mRNA TLR9 mRNA对照组 50 1.12±0.33 1.04±0.25 IM组急性期 98 2.71±0.95 6.75±2.13 t值 11.471 18.859 P值 0.000 0.000

表5 急性期与恢复期患儿外周血淋巴细胞亚群比较 （n=98，%，±s）

表5 急性期与恢复期患儿外周血淋巴细胞亚群比较 （n=98，%，±s）

时间 CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD16+56+急性期 82.17±5.78 17.45±5.97 55.16±10.81 6.94±3.76 7.34±3.81恢复期 73.53±7.56 27.57±7.31 40.34±8.65 12.69±4.10 12.75±5.02 t值 8.742 17.328 10.436 13.208 9.236 P值 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000

图1 IM患儿急性期EBV DNA载量与IL-1β、TLR9 mRNA的相关性

表6 急性期与恢复期患儿外周血清细胞因子水平比较 [n =98，pg/ml，M（P25，P75）]

表7 急性期与恢复期患儿外周血PMBCs 中TLRs mRNA相对表达量比较 （n=98，±s）

表7 急性期与恢复期患儿外周血PMBCs 中TLRs mRNA相对表达量比较 （n=98，±s）

时间 TLR7 mRNA TLR9 mRNA急性期 2.71±0.95 6.75±2.13恢复期 1.75±0.56 3.38±1.43 t值 5.688 8.923 P值 0.000 0.000

3 讨论

EBV感染在学龄前儿童中较为常见，易引起多种急性传染性疾病，其中IM 较为常见。蓝仙娥等[8]对25 185例学龄前儿童的血液标本进行EBV-EBNA1 IgG和EBV-VCA IgG 抗体检测，发现EBV 累积感染率为48.80%，其中IM患病率为7.90%。虽然IM 属于自限性疾病，预后良好，但是由于儿童机体免疫系统尚未发育完全，极少数患儿可能会伴发周围神经炎、脑膜炎、肝损伤等疾病[9]，机体不同免疫状态感染EBV 导致IM的转归和预后也存在较大差异。

EBV属于嗜B淋巴细胞DNA病毒，由于B淋巴细胞表面存在EBV受体，因此EBV 进入宿主体内后，主要附着于B淋巴细胞中。在感染潜伏期，EBVEBNA2可驱动B细胞大量增殖并分化成为记忆B细胞，但此时B淋巴细胞并不表达EBV 核蛋白，故EBV无自我复制能力。随着EBV感染的进展，携带EBV的B淋巴细胞在外周血中大量增殖，可诱导机体固有免疫应答清除大部分EBV 阳性B淋巴细胞，但是仍有极少部分B淋巴细胞逃避机体免疫系统的攻击，分化成浆细胞，释放出病毒颗粒，此时EBV感染进入急性期，逐渐表现出颈部淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大、发热、皮疹等临床症状[10]。CD19是B淋巴细胞表面的特异性糖基化跨膜蛋白标志分子[11]。本研究结果表明，IM急性期患儿CD19+较对照组降低，但是与EBV-DNA载量无直接关系,说明B淋巴细胞在EBV急性期并不能直接反映EBV的复制情况。这主要是由于绝大多数EBV 阳性B细胞被CTL 杀伤破坏，只有极少数B细胞被激活，进而刺激T淋巴细胞的活化和增殖，刺激机体发生获得性免疫应答。因此，在本研究中，IM急性期患儿CD3+和CD8+升高，同时CD4+降低。有研究提出，CD4+细胞不仅可以协助B细胞产生抗体，中和抗原，还能够诱导和维持CD8+细胞发挥细胞毒作用，进而影响EBV 阳性B细胞增殖，例如在CD4+细胞缺失时，CD8+细胞对EBV 阳性B细胞增殖的抑制作用不明显[12]。IM急性期患儿体内EBV 特异性CD4+细胞占血液循环CD4+细胞的1%左右，EBV特异性CD4+细胞可产生功能性细胞因子，进而抑制EBV诱导的B细胞转化；此外还可诱导特异性CD8+细胞识别EBV 裂解期抗原，进而杀伤EBV 阳性B细胞。与潜伏期相比，EBV 特异性CD8+细胞显著增殖，通过分泌穿孔素/颗粒酶直接杀伤感染EBV的B淋巴细胞，或通过肿瘤坏死因子途径诱导EBV感染的B淋巴细胞凋亡。当IM患儿进入恢复期后，CD4+升高，CD8+降低，说明机体免疫功能逐渐恢复正常，同时可避免效应T细胞的过度增殖，以及细胞因子大量分泌对机体造成的过度免疫损伤[13]。

此外，EBV在B淋巴细胞中建立潜伏感染后，树突状细胞、自然杀伤细胞均被激活，其表面TLRs可识别EBV 膜蛋白，并将信号传递给细胞内的各类接头分子，进而激活下游炎症因子，例如浆细胞样树突状细胞通过TLR9分子识别EBV 颗粒中的线性病毒DNA，而髓样树突状细胞则可通过TLR7 识别EBV 衍生的单链RNA，向初始T淋巴细胞传递EBV 抗原，并刺激初始T淋巴细胞分化为CTL、辅助性T细胞、调节性T细胞等，进而启动获得性免疫应答[14]。炎症反应与免疫破坏协同作用，可能是导致IM 预后不良的重要原因。本研究结果表明，IM急性期患儿外周血PBMC 中TLR7和TLR9 mRNA相对表达量显著升高，说明EBV感染可通过激活TLR7或TLR9 mRNA表达，使宿主B细胞存活，并借助细胞因子逃避宿主的免疫杀伤作用。EBV 除了通过影响TLRs的表达及信号传递影响B细胞增殖以外，还可以通过影响下游细胞因子的分泌，干扰机体抗病毒能力。在本研究中，IM急性期患儿血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平升高，也进一步证实EBV感染可通过TLRs信号通路诱发机体炎症反应，并且协助EBV的免疫逃逸。而患儿进入恢复期后，TLR7和TLR9 mRNA相对表达量降低，外周血淋巴细胞亚群逐渐恢复正常。VALENTE 等[15]研究证实，上调TLR7和TLR9 可促进干扰素调节因子IRF7的产生，进而激活EBVLMP1基因的表达。而IRF7与EBV 阳性B淋巴细胞的分化和增殖密切相关，因而干扰TLR7或TLR9 mRNA的表达有望成为治疗EBV感染的重要方法。

综上所述，IM患儿机体免疫系统、炎症反应及TLRs信号通路都与疾病的发生和转归有关，监测IM患儿不同时期外周血淋巴细胞亚群、细胞因子、TLR7和TLR9 mRNA变化，尤其是血清IL-1β和TLR9 mRNA的表达，有助于及时了解IM患儿的免疫状态及病情发展，为临床治疗提供一定的参考。