靶向超声造影在体定量评价大鼠移植后卵巢新生血管

王国栋，张 姗，狄 娜，穆玉明*

(1.新疆医科大学第一附属医院心脏超声诊断科，新疆 乌鲁木齐 830000；2.中山大学孙逸仙纪念医院超声科，广东 广州 510120)

卵巢移植技术为卵巢功能衰退患者提供了一种保存生育能力的有效方法[1-2]。移植后卵巢部位血管生成速度和密度直接影响卵巢存活和功能恢复[3]，但长期以来缺乏在体评价移植后卵巢新生血管状态的无创方法[4]。LI等[5]发现，通过连接肿瘤血管特异性配体，以靶向造影剂进行超声造影，可检测肿瘤新生血管。抗苗勒管激素(anti-Mullerian canal hormone, AMH)仅由卵巢颗粒细胞特异性分泌,其他组织少有表达[6-7]。本研究尝试通过制备具有卵巢组织靶向性的AMH-靶向纳米泡(AMH-targeting nanobubble, AMH-NB)，实现在体无创评价大鼠移植后卵巢新生血管。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备 选取SD雌性大鼠10只，鼠龄7～8周，体质量200～220 g，由新疆医科大学动物实验中心提供，伦理审查批准编号(SYSU-LACUC-2019-B463)。以3%戊巴比妥钠腹腔注射(45 mg/kg体质量)麻醉动物，摘除两侧卵巢后，立即将一侧卵巢皮质移植到右侧腹股沟区皮下，之后荷包缝合皮肤，建立大鼠自体卵巢移植模型[8]。将手术次日记为移植后第1天。

1.2 材料与设备 造影剂声诺维(SonoVue，Bracco公司)，AMH抗体(北京Bioss公司)，免疫组织化学一抗CD34(Abcom公司)，二抗即用型山羊抗兔二步法试剂盒，荧光二抗为AF-488，红细胞计数板。纳米泡粒径检测仪ZETASIZER Nano-ZS90，GE-vivid 7超声诊断仪，高频探头i13L，频率14 MHz。

1.3 制备非靶向微泡(non-targeting nanobubble, N-NB)和AMH-NB 采用“薄膜水化法”制备N-NB[9]，以“亲和素-生物素”桥接法构建AMH-NB[10]。采用共聚焦显微镜检测AMH是否与纳米泡连接。

1.4 超声造影 术后第7天麻醉并保定动物，选取造影模式，机械指数0.06，记录时间为10 min，经尾静脉团注6×106/ml造影剂0.1 ml，对全部大鼠分别随机采用3种造影剂(SonoVue、N-NB和AMH-NB)进行3次检查，每次间隔30 min。由2名分别具有工作7、8年工作经验的超声医师采用双盲法分析数据，通过造影时间-强度曲线获取峰值强度(peak intensity, PI)和达峰时间(time to peak, TTP)。

1.5 病理和免疫荧光分析 完成造影后，取9只大鼠，分为3组(每组3只)，每组分别注入1种造影剂，之后处死动物，留取移植后卵巢组织。参照刘艳丽等[11]方法以4%甲醛固定标本，石蜡包埋切片，行HE染色，并以SP法行CD34免疫组织化学染色。于光学显微镜下随机选取5个高倍镜视野(HP)计数呈棕黄色的阳性血管, 取平均值作为卵巢微血管密度[4](microvascular density, MVD)。制备冰冻切片，厚度为5 μm，经甲醇固定，加入一抗AMH抗体(1∶100稀释)，放入湿盒内4℃过夜；之后加入荧光二抗AF-488(1∶100稀释)，显色，脱水，封片，观察携带DiL的红色微泡在血管内外及其在组织间隙的微泡是否与AMH抗体结合。

1.6 统计学分析 采用SPSS 25.0统计分析软件。计量资料采用±s表示，行两独立样本t检验；用单因素方差分析进行多组比较，两两比较采用LSD法。采用Pearson相关性分析或线性回归分析观察PI、TTP与MVD的相关性：│r│≥0.8高度相关性, 0.5≤│r│<0.8中度相关性，0.3≤│r│<0.5低度相关性，0<│r│<0.3弱相关。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 N-NB和AMH-NB表征 纳米泡肉眼观为乳白色，光学显微镜下呈圆形结构。表面连接AMH抗体后的AMH-NB在激光共聚焦显微镜下呈绿色环状，分布均匀(图1)。ZETASIZER Nano-ZS90及红细胞计数板检测的N-NB、AMH-NB直径、浓度差异均有统计学意义(P均<0.05，表1)。

表1 N-NB与AMH-NB微泡直径及浓度比较(±s)

表1 N-NB与AMH-NB微泡直径及浓度比较(±s)

图1 N-NB和AMH-NB形态和粒径分布曲线图 显微镜下观察，微泡分布均匀，NB表面成功携带AMH抗体表达绿色(×400)

图2 超声造影图像及参数分析 白圈示ROI，AMH-NB超声造影增强幅度高于SonoVue及N-NB (*：P<0.05)

2.2 二维超声及超声造影 二维超声观察，移植后卵巢均见包膜形成。图2为SonoVue、N-NB及AMH-NB超声造影图像，单因素方差分析3组间造影参数PI、TTP差异均有统计学意义(F=83.04、666.17，P均<0.05，表2)，两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 病理 肉眼观察移植物表面呈粉红色具有光泽,可见丰富血管爬行其上，卵巢移植成功率为100%。光镜下移植后卵巢中可见未凋亡的卵泡，其形态正常。免疫组织化学CD34结果显示移植后卵巢组织的MVD平均值为(61.20±6.84)/HP(图3)。激光共聚焦观察，组织免疫荧光AMH-NB进入组织间隙与AMH结合，呈黄色(图4)。

2.4 相关性分析与线性回归分析 移植后卵巢MVD与AMH-NB造影所见PI、TTP呈高度相关(r=0.84、-0.84,P均<0.05)，SonoVue(r=0.67、-0.71，P均<0.05)、N-NB(r=0.65、-0.68，P均<0.05)造影所见PI、TTP分别与MVD呈中度相关(图5)。

3 讨论

AMH与卵巢移植物的存活及卵泡功能密切相关。研究[12]显示，通过检测AMH水平，可评价移植卵巢是否成活。血管相关抗体如CD31和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)被广泛用于血管靶点，但并无特异性，且卵巢移植物属乏血供器官，常规血管相关靶点并不能敏感识别其内新生血管，故本研究以AMH作为靶向超声造影的靶点。

制备靶向超声造影剂是实现靶向显影的前提。本研究所制备的造影剂N-NB及AMH-NB粒径均达到纳米级；NB携带抗体后粒径明显大于非靶向纳米泡，浓度也明显低于非靶向纳米泡，可能是携带抗体过程中需要反复离心和洗涤纳米泡所致，但AMH-NB的粒径仍为纳米级且浓度仍维持在2.9×108/ml，而体内实验所用微泡浓度为6×106/ml，对后续实验并无影响。

表2 采用3种造影剂进行超声造影所见大鼠移植卵巢组织参数PI、TTP比较(±s)

表2 采用3种造影剂进行超声造影所见大鼠移植卵巢组织参数PI、TTP比较(±s)

造影剂种类PI(dB)TTP(s)SonoVue4.15±0.8328.71±1.18N-NB6.16±0.4454.35±1.73AMH-NB7.93±0.6542.53±1.74F值83.04666.17P值<0.01<0.01

图3 病理组织学分析 A.光镜下观察HE染色片(×200)可见卵泡形态正常； B.CD34免疫组织化学染色(×400)见移植后卵巢新生血管表达，呈棕黄色

研究[13]表明，纳米泡的血管外渗能力优于普通微泡，其PI更高。本研究显示N-NB的PI较SonoVue增强1.5倍(6.16±0.44 vs 4.15±0.83)，可能因为纳米泡粒径较小，能克服普通微泡的局限性，通过血管内皮间隙进入卵巢组织间隙，增强渗透效应，利于保留，实现被动靶向作用[14]，集聚的纳米泡表现出较持续的超声增强显影效果，这一特性也为纳米泡靶向探测卵巢特异性表达分子奠定了基础。GAO等[15]报道，与非靶向纳米泡相比，靶组织对靶向纳米泡的摄取增强。本研究AMH-NB造影所示PI较N-NB增高1.3倍(7.93±0.65 vs 6.16±0.44)，组织免疫荧光成像显示NB在移植后卵巢组织间隙中呈现高度聚集状态，提示AMH-NB与AMH成功结合，进一步证实了AMH-NB的靶向性，与LI等[16]的研究结果一致，提示AMH是良好的分子影像学靶点。本研究针对大鼠自体移植卵巢，理论上亦适用于同样分泌AMH的异体移植卵巢[17]，通过AMH-NB可实现对移植后卵巢组织的靶向显影，并增强靶组织摄取解决了以往微泡不能进入组织间隙实现全面显影的难题。

图4 病理组织免疫荧光(×400) 细胞核DAPI染色表达蓝色荧光，AMH抗体染色表达绿色荧光，携带Dil的微泡表达红色荧光。SonoVue红色微泡不进入组织；N-NB红色微泡可在卵巢组织间隙表达，不与AMH结合；AMH-NB的组织间隙有大量红色微泡表达，在Merge中可与AMH结合，呈棕黄色

图5 相关性分析 SonoVue、N-NB、AMH-NB造影所示PI与MVD的线性回归方程(A～C)及SonoVue、N-NB、AMH-NB造影所示TTP与MVD的线性回归方程(D～F)

本研究SonoVue造影所示TTP明显早于NB，其原因如下：①SonoVue是血池显像剂，通过血管内皮间隙进入组织需要一定时间[18]；②血管管径越小，其阻力越大[19-20]，NB较SonoVue灌注的血管更细小、阻力更大，导致TTP延迟。AMH-NB的TTP较N-NB提前，可能是进入组织间隙的AMH-NB微泡能够快速与AMH结合，故TTP较快。通过比较TTP进一步验证了AMH-NB可增强移植后卵巢组织的靶向显影。

既往研究[21]于大鼠卵巢移植后第3天观察到毛细血管芽，5～10天可见完整的微血管网。MVD是评价新生血管的金标准[4]。本研究通过CD34染色证实卵巢移植物存在新生血管表达，相关性分析结果显示AMH-NB造影所示PI、TTP值与MVD呈高度相关，而SonoVue和N-NB造影所示PI、TTP值与MVD呈中度相关，表明以AMH-NB进行超声造影能有效量化评价大鼠移植卵巢的微血管密度。

本研究的不足之处：未能确定AMH-NB超声造影最佳造影参数；仅观察了移植后 7天卵巢早期新生血管，AMH-NB超声造影对移植后卵巢的长期检测效果有待验证。