消癖颗粒联合他莫昔芬对人乳腺癌细胞增殖、迁移、克隆、凋亡及细胞内DNA损伤程度的影响

韦任雄， 张玉柱， 陈前军

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510006；2.广东省中医院乳腺外科，广东广州 510120）

乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤[1]。目前，手术和药物治疗仍然是乳腺癌的两大治疗手段，在乳腺癌人群中约70%的患者属于雌激素受体（ER）阳性乳腺癌，因此可受益于内分泌治疗。他莫昔芬作为绝经前乳腺癌患者内分泌治疗的常用药物之一，其主要作用机制被认为是通过竞争性结合抑制ER形成稳定复合物，在核内有效地阻滞了DNA 的复制，从而抑制了肿瘤细胞的生长。研究[2]表明，他莫昔芬在治疗以及预防乳腺癌复发的同时，20%～30%的患者会出现耐药性，进而导致肿瘤的进展和转移。他莫昔芬耐药已经成为临床上面临的主要难题，它标志着内分泌治疗的失败。近年来许多研究[3-5]发现，他莫昔芬联合中药治疗可以有效提高他莫昔芬治疗的敏感性、降低副作用，预示了乳腺癌中西医结合治疗模式的临床应用前景。

消癖颗粒是国家名老中医林毅教授研制的中药复方制剂（在原消癖口服液系列制剂基础上组方优化而成），具有调摄冲任、疏肝解郁之功。既往消癖颗粒的临床Ⅰ期和Ⅱ期试验研究表明，其能有效缩小乳腺增生肿块、降低肿块密度、改善乳腺增生病的不良结构、缓解疼痛以及减轻伴随症状[6]，具有良好的治疗效果，且无毒副反应[7]。前期研究表明：消癖颗粒主要通过系统调节，尤其是对于肿瘤微环境的调节对乳腺中到重度不典型增生起阻断及逆转作用[8-10]，并具有抗癌活性；其对乳腺癌细胞MDA-231及MCF-7增殖生长具有抑制作用，并对乳腺肿瘤的生长及转移具有潜在疗效[10]。本研究选用ER+、孕激素受体（PR）+的人源乳腺癌细胞MCF-7和T47D作为研究对象，拟探讨消癖颗粒对其体外生物学行为的影响，并进一步分析消癖颗粒对他莫昔芬耐药的影响及其潜在机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞人源ER+、PR+乳腺癌细胞株MCF-7和T47D 由中山大学孙逸仙医院乳腺癌研究团队惠赠，以含有体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中，用2.5 g/L胰蛋白酶进行消化传代。

1.2 试剂细胞培养基RPMI-1640、青霉素-链霉素双抗、胰酶均购自北京迈晨科技有限公司；胎牛血清购自美国Invitrogen 公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性试剂盒（南京建成生物公司）；8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）检测试剂盒（USCN 公司）；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（美国Thermo公司）；原位末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）标记法（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（南京建成生物公司）。

1.3 仪器CKX41型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；VICTOR X5 型酶标仪（美国Bio Tek 公司）；KQ-100DE型数控浴式超声仪（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；1-15K 冷冻台式离心机（德国Sigma 公司）；FACS VantageTM流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

1.4 药物及制备消癖颗粒（专利号：ZL200510034765.8）由奇绩医药公司提供，包括淫羊藿、肉苁蓉、郁金、丹参、莪术、益母草、女贞子、制何首乌、鳖甲、牡蛎等中药成分。将消癖颗粒研磨成粉末，称取1 g 粉末溶解于20 mL 无血清RPMI-1640 培养基中（配成浓度50 mg/mL贮存液），水浴锅60 ℃超声浸泡80 min，共3 次。再经12 000 r/min 离心15 min 后，在无菌条件下用滤膜过滤备用。他莫昔芬购自扬子江药业集团有限公司，批号：08022501。称取5 mg 他莫昔芬粉末溶于1.345 8 mL 二甲基亚砜（DMSO）配成10 mmol/L贮存液于-20 ℃避光保存。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞毒性和细胞增殖能力 将对数生长期的MCF-7和T47D细胞，用胰蛋白酶溶液消化后吹打均匀并调整细胞浓度为4×104个/mL的细胞悬液，用排枪接种到96孔板，每孔100 μL，培养24 h。细胞贴壁后，用RPMI-1640 培养液稀释他莫昔芬贮存液加入96 孔板使终浓度为0、1、10、100、500 μmol/L，同样方法，加入消癖颗粒溶液使终浓度为200、400、600、800、1 000 μg/mL，继续培养24 h。计算每组设6个复孔，在37 ℃、体积分数5% CO2条件下继续培养24 h 后，每孔分别加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，应用酶标仪于570 nm 波长处测定吸光度（OD，D）值。取各复孔D（570 nm）值的平均值作为统计数据。不同浓度的消癖颗粒和他莫昔芬作用下的细胞生存率，细胞生存率= 实验组OD 均值/空白对照组OD 均值× 100%。根据单药对细胞生长抑制率检测结果，最后选择10 μmol/L 浓度的他莫昔芬以消癖颗粒（MCF-7：800 μg/mL；T47D：600 μg/mL）联合应用，再观察联合用药对MCF-7和T47D细胞增殖的抑制作用。空白组：仅加0.1%DMSO。消癖颗粒组：MCF-7 细胞，加消癖颗粒800 μg/mL；T47D 细胞，加消癖颗粒 600 μg/mL。他莫昔芬组：加10 μmol/L 他莫昔芬。联合用药组：MCF-7细胞，加消癖颗粒800 μg/mL、他莫昔芬10 μmol/L；T47D 细胞，加消癖颗粒600 μg/mL、他莫昔芬10 μmol/L。

1.5.2 酶联免疫吸附分析（ELISA）检测细胞上清液LDH含量[11]和细胞8-OHdG含量 取对数生长期的MCF-7或T47D 细胞，接种于6孔板，按设定的不同处理组别加入药物，处理24 h。收集上清，以1 500 r/min 离心5 min，按照试剂盒说明书进行样品测定，用酶标仪测定D（450 nm）值。收集细胞，用二喹啉甲酸（BCA）法测定细胞样本中的蛋白含量，采用ELISA 法测定8-OHdG 含量，用酶标仪检测D（450 nm）值，具体步骤和计算公式均按试剂盒使用说明书进行操作。

1.5.3 球囊形成实验 取处于对数生长期的MCF-7或T47D 细胞，以每孔 2 × 104个/mL，接种到6 孔板，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞孵箱中培养，细胞贴壁后按照上述分组给予不同的药物，观察细胞球形成过程，拍照并记录。

1.5.4 Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）双染色法测定细胞凋亡 取对数生长期MCF-7或T47D细胞进行消化、离心、重悬。将细胞接种于6孔板内并置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养24 h。使用不同处理组含药培养基处理细胞，放入37 ℃恒温培养箱继续培养72 h。使用无EDTA 胰酶消化细胞，收集细胞悬液，以1 500 r/min 离心10 min去上清。使用2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，再次以1 500 r/min 离心10 min 去上清。重复本步骤1 次后去除PBS。加入400 μL 的 Binding buffer 重悬细胞，将细胞分为2 管，每管200 mL，其中一管设为空白对照，另一管为处理组继续加入试剂进行处理。处理组加入5 μL AnnexinVFITC混匀后，再加入5 μL PI混匀后室温下避光孵育15 min。孵育完毕后于1 h 内应用流式细胞仪检测。

1.5.5 TUNEL 法测定细胞凋亡 用40 g/L 多聚甲醛固定细胞，避光条件下，按9∶1 混匀TUNEL 试剂盒中的A 液和B 液，加入配制好的TUNEL 反应液，加入待检测细胞爬片中，放入37 ℃恒温孵育1 h。PBS 清洗后封片，Hoechst 染料染细胞核5 min，在荧光显微镜下观察并拍照，计算凋亡率。凋亡率= TUNEL 阳性细胞数/Hoechst 细胞总数×100%。

1.5.6 划痕实验 以直尺比着在6 孔板背后划横线，将MCF-7或T47D 细胞接种在6孔板中，待细胞融合度达100%时，用200 μL tip 枪头用力均匀垂直地在培养孔中划痕后，PBS清洗3次，去除脱落细胞。按照上述不同分组，加入不同的含药培养基处理细胞。于0 h 和48 h 分别在相同位置拍照，比较各组划痕宽度。

1.5.7 平板克隆实验 将MCF-7 或T47D 细胞调整浓度为500 个/mL，以1 000 个/孔的细胞密度分别接种到6 孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。不同实验组加入对应的含药培养基。孵育2周后取出培养板，期间每3 d 更换1 次培养液。用PBS 清洗3 次。再用40 g/L 多聚甲醛固定20 min。然后吸去固定液，加适量0.02%结晶紫染色液染色30 min。光学显微镜下观察细胞集落。

1.6 统计方法采用SPSS 19.0系统软件进行数据分析，实验数据均用均数±标准差（±s）表示，多个样本间均数比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 消癖颗粒、他莫昔芬对乳腺癌细胞MCF-7和T47D 生长的影响图1 结果显示，他莫昔芬能够抑制MCF-7和T47D细胞的增殖作用，且呈浓度依赖性。他莫昔芬抑制MCF-7 和T47D 细胞增殖的IC50分别为12 μmol/L 和 10 μmol/L，各组间细胞增殖抑制率均有统计学差异（P＜0.05）。

将消癖颗粒联合他莫昔芬（10 μmol/L）干预细胞。从图2结果可知，联合用药组细胞增殖抑制率优于消癖颗粒单药组，各组间细胞增殖抑制率有统计学差异（P＜0.05）。消癖颗粒联合用药的最佳浓度中：MCF-7，800 μg/mL；T47D，600 μg/mL。消癖颗粒组、他莫昔芬组、联合用药组24 h 的细胞存活率较空白组明显降低（P＜0.05），且联合用药组细胞存活率低于他莫昔芬组和消癖颗粒组，差异有统计学意义（P＜0.05），消癖颗粒组和他莫昔芬组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示消癖颗粒与他莫昔芬联合用药对乳腺癌细胞的抑制作用明显优于消癖颗粒或他莫昔芬单用。

图1 他莫昔芬对乳腺癌细胞MCF-7和T47D存活率的影响（±s，n=3）Figure 1 Effect of Tamoxifen on the survival rate of breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

图2 消癖颗粒联合他莫昔芬对MCF-7和T47D细胞存活率的影响（±s，n=3）Figure 2 Effect of Xiaopi Granules combined with Tamoxifen on the survival rate of breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

LDH实验（图3）结果显示：消癖颗粒组、他莫昔芬组、联合用药组LDH 释放量较空白组增多（P＜0.05），其中以联合用药组最为显著。

上述结果综合提示，消癖颗粒对乳腺癌细胞（MCF-7：800 μg/mL；T47D：600 μg/mL）增殖有显著抑制作用，并且可以加强他莫昔芬对乳腺癌细胞增殖的抑制效果。

2.2 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对乳腺癌细胞MCF-7和T47D中8-OHdG含量的影响图4结果显示：与空白组比较，消癖颗粒组、他莫昔芬组、联合用药组细胞内8-OHdG 的含量均明显升高（P＜0.05），分别上升至空白组的2.40 倍、2.80 倍和3.60 倍。表明消癖颗粒和他莫昔芬均能促进乳腺癌细胞MCF-7和T47D中8-OHdG的含量增加，增加氧化损伤诱导细胞凋亡，且消癖颗粒能增强他莫昔芬诱导氧化损伤的作用。

图3 消癖颗粒联合他莫昔芬对MCF-7和T47D 细胞LDH释放的影响（±s，n=3）Figure 3 Effect of Xiaopi Granules combined with Tamoxifen on LDH release in breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

图4 消癖颗粒、他莫西芬单药及联合用药对MCF-7和T47D 细胞内8-OHdG表达的影响（±s，n=3）Figure 4 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on expression of 8-OHdG in breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

2.3 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对乳腺癌细胞球囊形成的影响乳腺癌细胞MCF-7 或T47D 在无血清培养基中培养48 h 后，可见少部分细胞贴壁，大部分细胞呈悬浮状态，并见少量肿瘤细胞球形成，悬浮生长，细胞数目5～9 个不等，细胞间连接紧密。继续培养观察，细胞球逐渐增大。培养5～7 d 后可观察到数十个细胞组成的细胞球，呈椭圆形或类圆形。图5、6 显示，培养8 d后在镜下，各组球囊的大小不一，联合用药组最小，消癖颗粒组和他莫昔芬组次之且大小相仿，空白组最大，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明消癖颗粒和他莫昔芬均能促进乳腺癌细胞增殖，且消癖颗粒能增强他莫昔芬抑制乳腺癌细胞增殖的作用。

2.4 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对乳腺癌细胞MCF-7 和T47D 凋亡功能的影响图7 结果显示，消癖颗粒组、他莫昔芬组、联合用药组绿光荧光强度较空白组明显增强，且联合用药组绿光荧光较其他3组明显增加。图8结果显示，空白组、消癖颗粒组、他莫昔芬组、联合用药组晚期凋亡率 MCF-7 分别 为：（2.07 ± 0.912）%、（9.27 ±2.422）%、（14.2 ± 3.866）%、（27.3 ± 5.224）%；T47D分别为：（1.44±0.844）%、（6.42±2.561）%、（9.28±4.464）%、（19.3±5.024）%。与空白组比较，其他3组细胞凋亡率增加，且联合用药较单药治疗能更显著诱导细胞凋亡，差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示消癖颗粒可以协同他莫昔芬诱导乳腺癌细胞凋亡。

图5 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对MCF-7和T47D 细胞培养8 d后球囊形成情况的影响（球囊形成实验，×200）Figure 5 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on balloon formation of breast cancer cells MCF-7 and T47D after 8-day culture（balloon formation assay，× 200）

图6 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对MCF-7和T47D 细胞球囊形成球径的影响（±s，n=3）Figure 6 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on size of spheroids of MCF-7 and T47D cells（±s，n=3）

2.5 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对乳腺癌细胞MCF-7 和T47D 迁移能力的影响图9 结果显示，相同的划痕实验检测时间点，空白组的划痕空间随着细胞的生长距离逐渐变短，而消癖颗粒组、他莫昔芬组、联合用药组细胞向划痕空间的生长速度显著低于空白组，距离相较于空白组稍宽（P＜0.05），其中，联合用药组细胞迁移能力明显减弱（P＜0.05）。上述实验结果表明，消癖颗粒对乳腺癌MCF-7和T47D细胞的迁移侵袭能力有显著影响，并且可以显著提高他莫昔芬对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用。

图7 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对乳腺癌细胞MCF-7和T47D凋亡功能的影响（TUNEL法，×200）Figure 7 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on apoptosis function of MCF-7 and T47D cells（by TUNEL assay，× 200）

2.6 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对乳腺癌细胞MCF-7 和T47D 克隆能力的影响图10 结果显示，空白组MCF-7和T47D的细胞克隆形成率最高，消癖颗粒组和他莫昔芬组次之，联合用药组最少，且与空白组比较，其他3组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明消癖颗粒对乳腺癌细胞MCF-7和T47D的克隆形成能力有显著影响，并且可以显著提高他莫昔芬对乳腺癌细胞克隆形成能力的抑制作用。

图8 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对乳腺癌细胞MCF-7和T47D凋亡功能的影响（流式细胞术）Figure 8 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on apoptosis function of MCF-7 and T47D cells（by flow cytometry）

图9 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对MCF-7和T47D细胞迁移能力的影响（划痕愈合实验）Figure 9 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on migration of MCF-7 and T47D cells（by scratch assay）

图10 消癖颗粒、他莫昔芬单药及联合用药对MCF-7和T47D细胞克隆能力的影响（克隆形成实验）Figure 10 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on clone ability of MCF-7 and T47D cells（by clone assay）

3 讨论

由于乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤，癌细胞的生长受体内多种激素的调控，其中，雌激素在大部分乳腺癌的发生发展中起着至关重要的作用。目前，他莫昔芬是内分泌治疗最常用的治疗药物之一，长期使用他莫昔芬后会引起诸多不良反应，如子宫内膜癌风险、潮热多汗等，干扰了乳腺癌治疗的连续性，影响患者的生存期[12-13]。而他莫昔芬的耐药性导致肿瘤的发展与转移，是目前临床治疗亟待解决的难题，严重影响了患者的生存及预后[14]。有研究表明，他莫昔芬耐药的机制可能与分子通路[15]、药物代谢酶CYP2D6基因多态性[16-17]、G 蛋白偶联ER[18-19]等有关。在这些机制研究中可以发现，耐药性癌细胞中活性氧簇（ROS）维持在较低水平[20]，此外，BARD1 和BRCA1 在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞中高表达，增强了癌细胞的DNA 损伤修复能力和对DNA 破坏性化疗的耐药性[21]。而他莫昔芬主要通过提高ROS 水平造成DNA 氧化损伤[22]，进而促进癌细胞的凋亡。因此，诱导癌细胞DNA 损伤，以提高耐药性癌细胞对药物的敏感性，为克服癌症耐药提供了新思路[23]。

乳腺癌在祖国医学体系属“乳岩”“乳石痈”等范畴。其发生主要是由于正气内虚、肝肾不足、冲任失调，加之七情所伤，脏腑失和，六淫邪毒乘隙内侵，内外合邪，致使经络受阻，气滞血瘀，痰凝毒聚而形成。乳腺癌的发生与诸多脏腑功能失调、痰瘀等病理产物以及冲任失调有关。其中，内分泌的紊乱与中医冲任失调关系最为密切。

在本次研究中，我们发现消癖颗粒可以抑制ER+、PR+乳腺癌细胞MCF-7 和T47D 的增殖，并且其抑制作用随浓度的增高而增强，具有剂量依赖性。消癖颗粒和他莫昔芬联合使用可使MCF-7和T47D细胞存活率明显下降。为了进一步验证联合用药的效果，我们采用了多种方法对细胞进行检测。首先从表型进行验证，通过划痕实验和平板克隆实验以及球囊形成实验，结果显示各组对乳腺癌细胞MCF-7和T47D的增殖、迁移以及抗凋亡功能的抑制能力顺序为：空白组＜消癖颗粒组＜他莫昔芬组＜联合用药组。进一步TUNEL 法和定量的Annexin V-FITC/PI 双染色法检测结果均验证联合用药可明显增强乳腺癌细胞MCF-7 和T47D的凋亡。8-OHdG 是敏感的DNA 损害生物指标，是最能反映机体内DNA 氧化损伤程度的标志物。他莫昔芬介导的DNA 氧化损伤是诱导细胞凋亡的重要途径之一[24-26]。消癖颗粒可促进MCF-7 和T47D 细胞中8-OHdG 生成增多，且联合他莫昔芬使用时其促进作用更为显著。

综上所述，消癖颗粒联合他莫昔芬可以协同发挥对乳腺癌细胞增殖抑制和促凋亡的作用。消癖颗粒作为已上市中成药，其安全性及毒副作用有所保障。目前消癖颗粒的具体作用机制尚未清楚，还需在进一步的研究中深入探讨，以为其临床应用提供理论基础。