2型糖尿病患者瘦素受体基因多态性与环境交互作用研究

王志迪 庞慧 崔萌 陈乐 赵灵燕，2

内蒙古医科大学1公共卫生学院预防医学实验中心，2慢性病分子流行病学重点实验室（呼和浩特010110）

近几十年来，全球糖尿病和糖耐量受损的发生率一直呈现逐年上升的趋势［1］。研究表明，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是受基因和环境共同作用影响的一种疾病［2］。瘦素受体（leptin receptor，LEPR）位于1p31 染色体上，通过激活信号转导子和转录激活因子在瘦素信号转导和葡萄糖代谢调节中发挥关键作用［3］，LEPR 基因已被认为是与T2DM 相关的候选基因之一［4］。一些可能对代谢调节有生物学影响的LEPR基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）已经被国内外学者进行了研究［5-6］。其中，有学者［7-8］发现瘦素受体rs1805096、rs1892534 和rs2211651 位点变异与T2DM发生具有相关性，但rs1805096单核苷酸多态性在法国人群中与增加胰岛素抵抗风险无明显相关性［9］。在过去几年中，许多研究者利用广义多因子降维法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）［10-11］来探索潜在的基因-基因或基因-环境交互作用，以发现复杂疾病可能的生物学途径。因此，本研究基于GMDR 模型探讨瘦素受体基因单核苷酸多态性与T2DM人群危险性的关系，通过纳入与T2DM发生相关的环境危险因素，进行基因-环境交互作用分析，旨在人群流行病学资料基础上探讨呼和浩特地区汉族人群T2DM的病因线索，为制定相关干预措施及政策提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料2017年10月至2018年8月在内蒙古医科大学附属医院、中医医院、国际蒙医医院收集T2DM 患者203 例（病例组），均符合1999年世界卫生组织制定的糖尿病诊断标准，年龄30 ～70 岁，无心、肺、肝、肾、脑等并发症或其他严重原发性疾病。选取同期在内蒙古医科大学附属医院体检中心健康体检的对照人群203 例，年龄30 ～70 岁，且经询问病史均无肝肾、高血压、内分泌及其他心血管疾病。全部受试对象均为汉族且无亲缘关系，并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般情况调查调查人员采用自行设计调查问卷进行面对面调查，调查内容包括年龄、性别、个人史以及既往疾病史等。按照标准方法进行体格检查，测量身高、体重、腰围、臀围等指标。

1.2.2 生化指标检测所有研究对象均清晨空腹8 h 以上，分别采外周静脉血5 mL 于EDTA 抗凝管和惰性分离胶促凝管内，离心后收集血浆、血清和全血细胞，测量空腹血糖及血脂四项，血清瘦素水平检测委托上海优选生物科技有限公司采用酶联免疫吸附试验进行。

1.2.3 DNA 提取及瘦素受体基因SNP 测定调查者血液样本采用试剂盒（天根生化科技有限公司）提取全血基因组DNA。应用紫外分光仪器检测OD260/OD280比值，超纯水为阴性对照，比值在1.8 左右，证明DNA 提取纯度合格。上海天昊生物科技有限公司设计本次实验PCR 扩增引物及多重单碱基延伸反应延伸引物（表1），并委托该公司采用多重高温连接酶检测反应技术进行LEPR 基因分型实验。反应体系（20 μL）包含1x HotStarTaq buffer，

3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc），1 μL 样本DNA 和1 μL 多重PCR 引物。PCR 循环程序：95 ℃2 min；94 ℃20 s、65 ℃和-0.5 ℃/cycle 40 s、72 ℃1.5 min，共11 个循环；94 ℃20 s、59 ℃30 s、72 ℃1.5 min，24 个循环；72 ℃2 min、4 ℃forever；在10 μL PCR 产物中加入5U SAP 酶和2U Exonuclease I 酶，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min；10x连接缓冲液1 μL、高温连接酶0.25 μL、5′连接引物混合液（1 μmol/L）0.4 μL，3′连接引物混合液（2 μmol/L）0.4 μL、纯化后多重PCR 产物2 μL、ddH2O 6 μL 混匀，连接程序：94 ℃1 min、56 ℃4 min，38个循环；4 ℃forever；取0.5 μL稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混匀，95 ℃变性5 min 后上ABI3730XL测序仪。收集的原始数据用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems，USA）来分析并输出结果。

表1 扩增的SNPs 的引物序列Tab.1 Primer sequence of amplified SNPs

1.3 统计学方法调查研究数据用Epidata 3.1 软件录入，通过SPSS 25.0（IBM，NewYork，USA）软件进行分析。正态分布计量资料用均数±标准差表示，满足参数检验条件资料时，组间比较采用t检验；不满足参数检验条件资料时用中位数（四分位间距）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料比较用χ2检验。双侧检验水准α = 0.05。采用二分类logistic 回归分析法分析LEPR 基因型频率及LEPR 基因位点在显性模型和隐性模型下与T2DM的关联性。应用SHEsis 在线平台进行连锁不平衡分析，Plink 1.07 软件分析单体型、最小等位基因频率（Minimum allele frequency，MAF）及Hardy-Weinberg 遗传平衡检验。基因型与环境危险因素交互作用应用GMDR 进行模型构建和分析。

2 结果

2.1 基本情况病例组空腹血糖值高于正常值6.1 mmol/L，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），两组在年龄、体质指数（BMI）、腰臀比（WHR）、血脂指标、高血压疾病史、高脂饮食、吸烟状况、饮酒上分布差异均无统计学意义（P＜0.05）。病例组血清瘦素水平稍高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 瘦素受体SNP 位点基因型频率分布LEPR基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 位点均符合Hardy-Weinber 遗传平衡定律。校正年龄等协变量后，基因型频率分布在两组间差异有统计学差异（P＜0.05），见表3。

2.3 瘦素受体SNP 位点单体型分析LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 各位点间r2值均大于0.8，存在连锁不平衡性，需进一步分析单体型，排除分布频率小于0.03 的单体型，表4结果显示LEPR 基因三个位点形成2 种单体型，校正年龄等协变量因素后，GCG 单体型在两组间分布差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 瘦素受体基因多态性与2 型糖尿病关联性分析二分类logistic 分析结果显示，校正年龄等协变量，rs1805096 携带（GG + GA）基因型个体与携带AA 型个体相比、rs1892534 携带（CC + CT）基因型个体与携带TT 基因型个体相比、rs2211651 携带（TG + GG）基因型个体与携带TT 基因型个体相比，T2DM 发病风险增加（OR＞1），差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

2.5 基因-环境交互作用分析一阶交互最优模型是rs1805096 与高脂饮食的交互作用，交叉一致性为10/10，测试集精准度为0.7432，模型差异有统计学意义（P= 0.001 0）。校正协变量因素后，三因素交互显示二阶模型中rs1805096、rs1892534 及高血压疾病史模型（P= 0.010 7）和rs1805096、rs2211651 及高脂饮食模型（P= 0.0010），差异均有统计学意义，见表6。

表2 病例组与对照组一般情况Tab.2 General situation of case group and control group±s

表2 病例组与对照组一般情况Tab.2 General situation of case group and control group±s

注：*为P ＜0.05

参数性别（男性）年龄（岁）BMI（kg/m2）WHR空腹血糖（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）总胆固醇（mmol/L）高密度脂蛋白（mmol/L）低密度脂蛋白（mmol/L）血清瘦素（ng/L）糖尿病家族史［例（%）］是否高血压疾病史［例（%）］是否吸烟［例（%）］是否饮酒［例（%）］是否高脂饮食［例（%）］是否体育锻炼［例（%）］是否病例组118 57.05±10.29 25.92±5.30 0.92±0.83 8.67±3.76 2.13±1.53 4.95±1.31 1.29±0.37 2.84±0.96 12.25±3.08 35（17.24）168（82.76）80（39.41）123（60.59）76（37.40）127（62.60）79（38.90）124（61.10）150（73.90）53（26.10）117（57.60）86（42.40）对照组110 49.68±10.65 23.43±3.60 0.84±0.78 5.21±1.96 1.53±1.14 4.57±1.05 1.23±0.42 2.65±0.73 12.13±2.86 31（15.27）172（84.73）7（3.40）196（96.60）46（22.70）157（77.30）47（23.20）156（76.80）35（17.20）168（82.80）113（55.70）90（44.30）t/χ2值0.64-7.02-5.52-10.31-11.51-4.12-3.15-1.53-2.24-0.34 0.29 77.96 10.54 11.78 131.32 0.16 P值0.424＜0.001*＜0.001*＜0.001*＜0.001*＜0.001*0.002*0.128 0.028*0.736 0.592＜0.001*0.001*0.001*＜0.001*0.689

表3 瘦素受体SNP 位点基因型频率分布Tab.3 Genotype frequency distribution of leptin receptor SNP loci

3 讨论

基因与环境因素是T2DM 发病的重要因素［2］，虽然既往研究［12-13］表明了LEPR 基因与糖尿病密切相关，但该基因rs1805096、rs1892534、rs2211651与T2DM 发生的关系，特别在呼和浩特地区汉族人群中并未明确。因此，本研究纳入406 例研究对象进行病例对照研究，发现内蒙古呼和浩特地区汉族人群LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 位点单核苷酸多态性与T2DM 易感性相关。

表6 瘦素受体各基因位点与环境交互作用GMDR 分析结果Tab.6 GMDR analysis result of interaction between leptin receptor gene loci and environment

在动物模型中，小鼠LEPR 基因纯合常染色体突变可导致肥胖和胰岛素抵抗，通过引入神经元特异性LEPR-B 转基因可逆转这一现象，这证实了LEPR 基因在糖尿病发病中的关键作用［14］。有研究发现，血清瘦素水平升高可导致β 细胞受损甚至凋亡，从而引发胰岛素抵抗［15］，本研究中病例组的瘦素水平高于对照组，但差异无统计学意义，可能与样本量较小有关。

校正年龄等协变量后，LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 基因型频率分布在两组间差异有统计学意义。本研究结果显示，rs1892534 位点（CC + CT）基因型与TT 基因型比较，T2DM 患病率增加2.905 倍，rs2211651 位点（TG + GG）基因型是TT 基因型患病率的2.604 倍，相关研究表明［16］，rs1892534 位点与C 反应蛋白的表达水平相关，现有证据证实，C 反应蛋白水平的变化可能是导致T2DM 发生的危险因素之一［17］。且LIAO 等［8］在中国台湾人群中发现rs1892534 和rs2211651 位点变异与早发型T2DM 患者的遗传易感性有关联，与本研究结果一致。在本研究中，rs1805096 位点（GG+GA）基因型是AA 基因型患病率的2.905 倍，一项Meta 分析结果发现［7］，中国人群rs1805096 位点在显性遗传模型下与T2DM 及肥胖具有相关性，但PHILLIPS 等［9］研究发现，在法国人群中，rs1805096单核苷酸多态性与增加成人胰岛素抵抗和代谢综合征的风险无关联，除此之外，DIAS 等［18］在巴西人群队列研究的结果显示，rs1805096 突变与代谢异常无关，这种差异可能是由于种族和背景的不同所导致。

研究表明，位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP 等位位点被称作单体型，T2DM 是多基因复杂性疾病，单体型分析比单个SNP 分析更具有优势。本研究单体型分析表明，rs1805096-rs1892534-rs2211651 单 体 型GCG 与T2DM 风 险增加相关（OR= 2.588，95%CI：1.307 ～5.125），既往有研究发现LEPR 基因Arg109Lys、Asn656Lys、Pro1019Pro 位点AGC 单体型可能是中国华北地区T2DM 的危险因素，但目前关于rs1805096-rs1892534-rs2211651 构成的单体型与T2DM 的关联分析研究未见报道。

GMDR 是一种新颖而强大的检测和建模上位性的统计工具，基本原理包括交叉验证和计分统计量，利用降维的方法来检测基因-基因、基因-环境之间相互作用，避免了Logistic 回归模型等方法处理交互作用存在“维度灾难”等局限性，从而导致研究结果假阳性率增加［19］。基因-基因、基因-环境交互作用分析已经广泛应用于T2DM 的研究，ZHOU 等［20］发现GCKR 和G6PC2 基因交互作用可能增加中国汉族人群T2DM 发病风险；LI 等［21］发现TCF7L2 基因与BMI 和腰围之间的交互作用可能在T2DM 发生风险中起重要作用。GMDR 分析交互作用时，当交互阶数越高，需要样本量越多才能获得更稳定的结果，本研究受样本量限制，将LEPR 基因的三个基因位点分别与环境因素（糖尿病家族史、高血压疾病史、吸烟、饮酒、高脂饮食、体育锻炼）引入模型，校正年龄等协变量，分析基因-环境交互作用，结果显示一阶交互最优模型是rs1805096 与高脂饮食的交互作用，交叉一致性为10/10；二阶模型rs1805096、rs1892534 及高血压疾病史模型和rs1805096、rs2211651 及高脂饮食模型均存在交互作用。

综上所述，本研究发现内蒙古呼和浩特地区汉族人群LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 位点单核苷酸多态性与T2DM 易感性相关，GCG 单体型与T2DM 风险增加相关，且LEPR基因rs1805096、rs1892534 及高血压疾病史模型和rs1805096、rs2211651 及高脂饮食模型之间的交互作用可能与T2DM 的发生有关联。本研究存在一定的局限性，仅探讨了呼和浩特地区汉族人群，且样本量有限，今后我们将继续加大样本量，进行多地区不同民族、不同环境因素的研究，进一步验证LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 与2 型糖尿病之间的关系。