外源脯氨酸对自然干旱下白刺叶片渗透调节与抗氧化酶活性的影响

马鹏图，苏世平，李毅，种培芳，后有丽，魏斌

(甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070)

水分是干旱和半干旱生态系统中，决定生态系统结构与功能的重要环境因素，而干旱半干旱区降水稀少、蒸发量大，导致土壤水分缺失严重，植物遭受干旱胁迫造成的伤害[1-2]，使得植物的生理生化特征发生一系列变化，对植物的生长发育也产生一定影响，甚至导致植物死亡[3].

脯氨酸(Proline，Pro)分子量小、水溶性大、对细胞无毒副作用，是植物体内最重要的有机渗透调节物质之一，它能够清除植物体内自由基，提高抗氧化物酶保护作用[4].外源Pro可以提高逆境胁迫下植物的抗氧化能力促进植物生长，从而提高植物耐受能力[5-6].白刺(Nitrariatangutorum)，蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(NitrarisL.)强旱生小灌木，是我国西北荒漠、半荒漠植被的重要建群种之一，主要分布于西藏东北部、甘肃、青海、新疆、内蒙古西部、宁夏西部、陕西北部的湖盆地区和风沙沿线以及荒漠、沙地、盐碱地和戈壁等[7-10].因其根系发达，抗风沙能力强，在防风固沙，水土保持以及涵养水源中起着重要作用[11-12].目前，白刺的研究主要集中于不同干旱胁迫对其生理特性的研究[13-14]、抗旱性研究[15-16]、抗旱优良家系选择[17]、扫描电镜观察[18]以及解剖学研究[19-20]等方面，但未见外源Pro对自然干旱下白刺叶片渗透调节物质及抗氧化酶活性的研究.本研究拟通过对处在干旱胁迫中的白刺苗木喷施一定质量浓度的外源Pro，以期改变白刺体内渗透调节物质含量及抗氧化物酶活性，进而缓解其干旱胁迫程度，并揭示外源脯氨酸的作用机理.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于甘肃省武威市林业综合服务中心良种繁育基地(E 103°51′，N 38°38′)，地处甘肃省河西走廊东北部，该区属典型的温带大陆性荒漠气候，海拔1 378 m，年均气温7.6 ℃，年均降水量113.2 mm，年均蒸发量2 604.3 mm，据2018年武威市气象资料显示，5～7月气温较高，降水较少，干旱较为严重，对植物的正常生长造成了一定的伤害.

1.2 试验材料处理

1.2.1 外源Pro处理 选择同一家系、大小、生长基本一致的白刺苗木，在2018年4月～7月停止对试验地的人工灌溉，让其自然干旱，土壤水分主要依靠自然降水.于7月13日进行外源Pro处理， Pro设置5个质量浓度梯度(P1：50 mg/L、P2：100 mg/L、P3：150 mg/L、P4：200 mg/L、P5：250 mg/L)，以喷施蒸馏水为对照(CK)，重复3次，即每个处理3株白刺[21].用喷壶于无风晴天的时候在白刺叶片喷施Pro，以喷施部位挂满水珠下滴为止.以处理当天为第0天，在处理前先采集白刺叶片，之后以Pro处理时间为准，分别在第1天、第3天、第6天和第9天[22]相同时间采样，采后放入液氮罐中保存待用.同时在采样期间，用塑料薄膜遮挡，防止自然降水的影响.

1.3 测定指标与方法

可溶性糖(soluble sugar)含量采用蒽酮-乙酸乙酯比色法测定[23]，可溶性蛋白(soluble protein)含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[24]，游离Pro含量、超氧物歧化酶(superoxide)活性以及过氧化物酶(peroxidase)活性分别采用磺基水杨酸提取法、氮蓝四唑法和愈创木酚法测定[25]，过氧化氢酶(catalase)活性采用紫外吸收法测定[26]，叶绿素(chlorophyll)含量指标采用丙酮提取法测定[27].

1.4 数据统计分析

采用Excel 2010进行数据整理及作图，SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 外源Pro对白刺叶片Pro含量的影响

随着处理天数的增加，不同处理下白刺叶片游离Pro含量总体呈现升高的趋势(图1).与处理当天相比，各质量浓度处理下Pro含量逐渐升高，但升高的幅度不同，CK升高幅度最小，除处理后第1天叶片Pro含量较处理当天有显著降低(P<0.05)外，其余各处理不同处理天数间差异不显著(P>0.05)；CK处理下白刺叶片Pro含量较第0天差异不显著(P>0.05)；与CK相比，当Pro质量浓度大于100 mg/L时，各质量浓度处理下Pro含量均高于CK，且随着Pro处理质量浓度的增加，不同处理天数下白刺叶片Pro含量总体呈现逐渐升高的趋势.其中，P5处理升高幅度最大，不同处理天数Pro含量显著高于处理当天(P<0.05)，在处理后第9天时Pro含量升高到最大值，较处理当天上升了83.9%，达到显著水平(P<0.05).

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，相同字母表示不同处理间差异不显著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分别表示处理当天、处理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.图1 外源Pro对自然干旱下白刺叶片游离脯氨酸含量的影响Figure 1 Effect of exogenous Pro on proline content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.2 外源Pro对白刺叶片Chl含量的影响

随着处理天数的增加，白刺叶片的Chl含量呈先下降后上升的趋势(图2)，与处理当天相比，各处理Chl含量总体呈下降的趋势，但下降的幅度不同，CK下降幅度较小，除处理后第3天叶片Chl含量较处理当天有显著降低(P<0.05)外，其余各处理天数间差异不显著(P>0.05)；与CK 比较，一定处理天数内，Pro处理下白刺叶片Chl含量高于CK.其中在P2处理下Chl含量下降幅度最大，上升幅度也较大，处理后第3天时Chl含量达降到最小值，较第0天下降了49.9%，差异显著(P<0.05)；与 CK 相比，各处理天数下P1、P2、P3、P4和P5处理后叶片Chl含量均低于CK，其中，在处理后第9天时，P3处理叶片Chl含量最低，较CK降低了37.2%，且达到差异显著水平(P<0.05).

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，相同字母表示不同处理间差异不显著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分别表示处理当天、处理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.图2 外源Pro对自然干旱下白刺叶片叶绿素含量的影响Figure 2 Effect of exogenous Pro on chlorophyll content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.3 外源Pro对白刺叶片POD活性的影响

随着处理天数的增加，不同质量浓度处理的白刺叶片POD活性总体呈先上升后下降的趋势(图3)，与处理当天相比，各处理在处理后一定天数内叶片POD活性均上升，但上升幅度不同，CK 上升幅度较小，其余处理天数下POD活性与处理当天无显著性差异(P>0.05)； 且与CK相比，一定处理天数内，Pro处理白刺叶片POD活性均高于CK.在P2和P3处理下，POD活性较CK达到了差异显著水平(P<0.05)，且P2处理下POD活性上升幅度最大，下降幅度也较大，在处理后第3天时POD活性达到最大值，较第0天上升了26.4%；P1、P4和P5处理下各天数间POD活性较第0天差异不显著(P>0.05)；处理后第9天时，P2处理下的POD活性较CK上升幅度最大，且上升了41.4%，达到显著水平(P<0.05).

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，相同字母表示不同处理间差异不显著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分别表示处理当天、处理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.图3 外源Pro对自然干旱下白刺叶片过氧化物酶活性的影响Figure 3 Effect of exogenous Pro on peroxidase activity in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.4 外源Pro对白刺叶片SOD活性的影响

随着处理天数的增加，白刺叶片SOD活性呈先上升后下降的趋势(图4)，与处理当天相比，各处理在处理后一定天数内叶片SOD活性均上升，但上升幅度不同，CK 上升幅度较小，下降幅度也较小，除处理1 d后叶片SOD活性较处理当天差异显著(P<0.05)外，其余处理天数下均无显著性差异(P>0.05)；与CK相比，一定处理天数内，不同质量浓度Pro处理下白刺叶片SOD活性升高，但升高的幅度不同.其中，P2处理下SOD活性下降幅度最大，在处理后第9天时SOD活性降到最小，较第0天下降了24.6%，达到显著水平(P<0.05)；CK处理下，处理后1 d SOD活性下降，且与第0天差异显著(P<0.05)，其余天数下均无显著性差异(P>0.05)；在处理后第9天时，P2处理下的SOD活性与CK相比下降幅度最大，较处理当天下降了30.4%，且达到显著水平(P<0.05).

2.5 外源Pro对白刺叶片CAT活性的影响

随着处理天数的增加，白刺叶片CAT活性呈先上升后下降的趋势(图5)，与处理当天相比，各处理一定天数内叶片CAT活性上升，但上升的幅度不同，CK 上升幅度较小，除处理第3天叶片CAT活性较处理当天差异显著(P<0.05)外，其余处理天数下均无显著性差异(P>0.05)；其中，P2处理下CAT活性上升幅度最大，下降幅度也较大，在处理后第3天时CAT活性达到最大，较第0天上升了45.1%，达到差异显著水平(P<0.05)；与CK相比，各处理天数下P1、P2、P3、P4和P5处理后叶片CAT活性均低于CK，一定处理天数内，Pro处理下白刺叶片CAT活性有所上升，但上升幅度不同.处理后第9天时，除CK和P5处理下的CAT活性较第0天差异不显著(P>0.05)，其他不同质量浓度Pro处理下CAT活性较第0天显著降低(P<0.05)，分别下降了39.7%、64.9%、46.1%和30.8%.

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，相同字母表示不同处理间差异不显著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分别表示处理当天、处理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.图4 外源Pro对自然干旱下白刺叶片超氧物歧化酶活性的影响Figure 4 Effect of exogenous Pro on superoxide dismutase activity in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.6 外源Pro对白刺叶片SS含量的影响

随着处理天数的增加，不同处理下白刺叶片SS含量总体呈现先降低后升高的趋势(图6).与处理当天相比，各处理在处理后一定天数内SS含量均降低，但降低幅度不同，P2处理下降低幅度最大.在CK处理下，各天的SS含量随着外源Pro质量浓度的增加呈先降低后升高的趋势，不同天数下增加速度和积累能力不同.CK和P1处理下，不同天数间白刺叶片SS含量较第0天差异均不显著(P>0.05)；在P2处理下白刺叶片SS含量降低幅度最大，各处理天数下SS含量显著低于处理当天(P<0.05)，在处理后第3天时，SS含量达到最小值，较第0天下降了33.7%，达到显著水平(P<0.05)；在P3处理下白刺叶片SS含量降低幅度较小，在处理第9天时差异不显著(P>0.05)；与CK相比，不同质量浓度处理下不同处理时间SS含量均高于CK，在处理后第9天时，P2处理SS含量较第0天显著降低了32.2 %(P<0.05).

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，相同字母表示不同处理间差异不显著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分别表示处理当天、处理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.图5 外源Pro对自然干旱下白刺叶片过氧化氢酶活性的影响Figure 5 Effect of exogenous Pro on catalase activity in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，相同字母表示不同处理间差异不显著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分别表示处理当天、处理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.图6 外源对自然干旱下白刺叶片可溶性糖含量的影响Figure 6 Effect of exogenous Pro on soluble sugar content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

2.7 外源Pro对白刺叶片SP含量的影响

随着处理天数的增加，不同处理下白刺叶片SP含量总体呈现先降低后升高的趋势(图7).与处理当天相比，各处理在处理后一定天数内SP含量降低，但降低幅度不同，P2处理下降低幅度最大.随着处理天数的增加，CK处理下SP含量呈先降低后升高的趋势，SP含量仅在处理后3 d下降；与CK相比，不同天数下，不同质量浓度处理下的SP 含量均高于CK，其中P2处理下白刺叶片SP含量降低幅度最大，且升高幅度较小，处理后第1天SP含量达到最小值，较第0天下降了69.2%，达到显著水平(P<0.05)；P3处理下，第1天、第3天和第6天的SP含量较第0天差异显著(P<0.05)；P4和P5处理下白刺SP含量较第0天差异不显著(P>0.05)；在处理后第9天时，P2处理下白刺SP含量较CK上升最高，上升了37.1%.

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，相同字母表示不同处理间差异不显著(P>0.05)，0 d、1 d、3 d、6 d、9 d分别表示处理当天、处理后第1天、第3天、第6天、第9天.Different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05),and the same letters indicate no significant differences between different treatments (P>0.05),0 d,1 d,3 d,6 d,and 9 d respectively represent the day of treatment,the first day,the third day,the sixth day,and the ninth day after treatment.图7 外源Pro对自然干旱下白刺叶片可溶性蛋白含量的影响Figure 7 Effect of exogenous Pro on soluble protein content in leaves of Nitraria tangutorum under natural drought stress

3 讨论

干旱胁迫是荒漠区植物最容易遭受的环境胁迫.植物在受到干旱胁迫时，其体内的渗透调节系统和抗氧化酶系统发挥作用，应对干旱胁迫给植物带来的伤害[28].

渗透调节是植物适应干旱胁迫的重要生理机制，植物可以依靠细胞内渗透调节物质含量的变化来调节渗透胁迫压力[29].Pro是植物体内重要的一种渗透调节物质，当植物在遭受逆境条件时其体内的Pro含量会大量积累[30]，同时起到保护作用，在正常情况下游离Pro含量较低，在受到干旱胁迫时含量会明显上升，且在植物组织中起着维持渗透调节平衡和稳定细胞机构等作用.在植物生理干旱时，植物体内的Pro含量会大量积累，植物细胞内溶质积累，渗透势降低，维持膨压的平衡[31].Pro的增加有助于细胞维持水分，从而减少水分的蒸发或散失，维持细胞水分平衡[32-33].在干旱胁迫下Pro会影响植物正常的光合作用、抗氧化酶活性等一系列的生理活动，植物对养分的吸收也会因此受到不同程度的影响；同时，干旱胁迫会导致植物叶片光合作用受到抑制，抗氧化酶活性降低，影响干物质的积累[34].本研究中，通过喷施外源Pro能够增加自然干旱胁迫下白刺叶片的游离Pro含量，在同一处理下，白刺游离Pro含量随着天数的增加而增加，且当 Pro质量浓度为250 mg/L时，游离Pro含量达到最大值，这与黄燕等[35]的研究一致.武术杰等[36]研究发现，随着干旱胁迫的加剧，SS含量和SP含量总体呈上升的趋势，在干旱胁迫下，SS和SP可作为反映植物抗逆性的生理指标，本研究发现在干旱胁迫下喷施一定质量浓度的外源Pro后，白刺SS和SP含量都有减少，表明白刺可通过此方式提高其吸保水能力，进而调节细胞渗透势，提高植物抗旱能力，试验也得出适当质量浓度的Pro处理增强了这种调节机制从而减轻干旱胁迫造成的伤害的结论.当处理天数大于3 d时，SS和SP含量逐渐上升，可能是由于外源Pro作用效应有所减弱.在质量浓度为100 mg/L的外源Pro处理下SS和SP含量降低程度最大，且上升最慢.Chl是植物进行光合作用的主要细胞器，植物叶片的Chl含量是光合作用强弱的重要指标，同时也能够影响植物与外界能量及环境物质和能量的交换[37-38].有研究表明，Pro在使用过程中存在明显的浓度效应，适宜浓度可以有效清除植株体内活性氧，减轻自然干旱胁迫下对Chl的破坏作用[39].本研究表明干旱胁迫下，随着天数的增加，白刺Chl含量先呈下降趋势，而随着外源Pro的加入其含量逐渐增加，且当喷施时间超过3天时，白刺Chl含量增加幅度较大，这与张牡丹等[40]的研究结果不一致，这可能是因为植物体内叶绿素的合成是一个复杂的过程，它除了受光照、稀土元素等外部环境条件调控以外，其内在基因调控也十分重要，因此喷施外源Pro会出现叶绿素合成滞后的现象，导致白刺Chl含量逐渐增高.说明外源Pro的加入提高了植物对逆境胁迫的适应性，维持了植物的正常生长.

植物在遭受干旱和高温等环境因素胁迫时，植物为保护自身免受伤害会形成一套相应的抗氧化保护系统，此时植物的抗氧化物酶活性会相互协同发挥作用，使植物体内活性氧的产生和清除机制处于动态平衡[41-42].SOD、POD、CAT等抗氧化酶，是植物活性氧清除系统中重要的酶，能够维持活性氧自由基产生与清除系统的平衡.植株在正常条件下生长，其体内活性氧的产生和清除处于一个动态平衡，不会对植株造成伤害[43].本研究表明，喷施适宜质量浓度的外源Pro可以有效地增加白刺叶片的POD、SOD和CAT活性，提高了白刺的抗氧化能力，减免胁迫条件对植株的伤害，有效清除植物内自由基含量[44]，从而提高白刺的耐旱性.这与陶爱芬等[45]的研究结果一致.本研究中，适宜质量浓度的Pro(100、150 mg/L)可以明显地提高白刺POD、SOD和CAT活性，这说明喷施外源Pro能提高白刺POD、SOD和CAT活性，抗氧化酶之间通过协同作用来增强活性氧清除能力，以此来减轻活性氧对植物叶片的伤害，这与苏贝贝等[46]的研究结果一致.

4 结论

本研究结果表明，喷施一定的外源Pro能够降低白刺叶片SS、SP和Chl含量，提高白刺叶片Pro含量以及POD、SOD和CAT活性，对干旱胁迫的伤害起到了一定的缓解作用；当Pro质量浓度大于100 mg/L时，Pro作用会减弱.说明喷施适宜质量浓度的Pro可以提高白刺渗透调节能力和过氧化物酶活性，在一定程度上缓解了干旱胁迫对白刺的伤害.