低温胁迫下核桃枝条抗寒性综合评价

吴硕，贾彦丽，智福军

(河北省农林科学院 石家庄果树研究所，河北 石家庄 050061)

核桃 (JuglansregiaL.) 为胡桃科胡桃属落叶乔木，其果实可作干果，又可作油料，是重要的木本油料树种[1-2]。低温伤害是北方核桃生产中存在的主要问题，尤其核桃幼树，枝条髓心大、含水量高，极易遭受冻害影响[3-6]。近年来，随着全球变暖带来的极端气候频发，冻害发生普遍且有加重趋势，已成为制约核桃生产的突出问题[7-9]。因此评价和筛选抗冻核桃品种对于核桃生产的防冻减灾和抗冻育种都有重要的指导意义。

前人研究发现，核桃茎叶的组织结构、胞膜透性、细胞结构紧密度可以作为核桃品种抗寒性鉴定的预选指标[6-7，10]。在低温条件下，植物膜透性、电导率、组织含水量、渗透调节物质(可溶性糖和可溶性蛋白等)以及保护酶活性等都会发生变化[11-14]，抗冻和易受冻害品种的物质含量和变化趋势显著不同，可以作为品种抗寒性评价标准。

本研究拟评价2个从赞皇优选的抗冻核桃品系，通过与已知的较抗寒品种辽宁1号和抗寒性较差的清香品种在不同低温处理下，对比与抗寒性相关的各项保护酶活性和渗透调节物质指标，分析抗寒性生理生化指标含量和变化规律，明确优选试材抗寒性，为筛选抗冻核桃品种及抗冻育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年12月11日，在赞皇嶂石岩下北庄采集赞核1号(Ⅰ)和赞核2号(Ⅱ)2个核桃优系，以及较抗寒品种辽宁1号(Ⅲ)和较不抗寒品种清香(Ⅳ)2个品种的1 a生无病虫害、无机械损伤的枝条，带回石家庄果树研究所中心实验室内。

将采集的枝条剪成25 cm的枝段，用自来水冲洗数遍，洗掉泥土、灰尘，再用蒸馏水冲洗 3次，用洁净的纱布擦干水分，保鲜袋封装备用。每个品种(系)的枝条分成等份的4份，每份10根。处理温度设置为CK(对照，0 ℃)，-10 ℃，-20 ℃和-30 ℃，以-5 ℃每小时降温，降至所设温度后维持12 h，然后以5 ℃每小时升温至0 ℃。每处理重复3次。

1.2 试验方法

将处理后枝条，剪成1～2 mm碎片，混匀后液氮速冻，锡纸包裹后装保鲜袋-70 ℃保存。用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、可溶性糖和可溶性蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 低温对核桃1 a生枝条SOD活性的影响

超氧化物歧化酶(简称SOD)能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。环境胁迫可造成体内抗氧化酶系统紊乱，SOD酶活性下降，活性氧自由基大量积累，膜完整性下降。因此。SOD活性与植物逆境下抗逆能力密切相关。核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下SOD活性变化情况见图1。

图1 核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下SOD活性变化Figure 1 Changes of SOD activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由图1可知，4个品种(系)1 a生枝条随温度下降变化趋势不同，其中Ⅰ和Ⅱ变化相似，随温度变化，呈现升-降-升的趋势。Ⅲ在0 ℃至-20 ℃变化趋势与Ⅰ和Ⅱ相同，但在温度由-20 ℃降至-30 ℃时，SOD酶活性仍呈下降趋势。Ⅳ变化趋势则与其余品种相反，呈现降-升-降的变化趋势。

在0 ℃时，Ⅳ SOD活性显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，为325 U/g。随温度下降，I活性变化不显著，变化幅度仅为20 U/g。在-10 ℃时I和ⅢSOD酶活性达到顶峰，分别为204 U/g和223 U/g。Ⅱ在-30℃时酶活性最高，为201 U/g。

在0 ℃时Ⅳ的 SOD活性显著高于其余品种(系)，表明SOD酶活性已经被激活，用于消除低温带来的活性氧伤害。也表明Ⅳ受低温冻伤程度明显高于其余品种(系)。此后随温度下降，Ⅳ的SOD活性均低于0 ℃时，表明低温已对其造成伤害，部分细胞受到冻害，SOD活性下降。Ⅰ、Ⅲ和Ⅱ的SOD活性分别在-10 ℃和-30 ℃达到峰值，表明在此温度下SOD活性被完全激发，表明其抗寒能力均高于0 ℃时达到峰值的Ⅳ。

2.2 低温对核桃1 a生枝条CAT活性的影响

过氧化氢(Hydrogenperoxide，H2O2)是生物细胞代谢过程中产生的一种活性氧。逆境胁迫下，活性氧的产生量超过系统清除能力，由此造成氧化损伤。植物在低温胁迫下，体内CAT酶活性代表植物对低温的抗性能力。核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下CAT活性变化情况见图2。

图2 核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下CAT活性变化Figure 2 Changes of CAT activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由图2可知，在低温胁迫下，4个品种(系)枝条中CAT活性同SOD活性一致，呈现出2种不同的变化趋势。其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ变化趋势相同，CAT活性随低温胁迫的加剧呈逐步增加的趋势。Ⅳ的CAT含量变化趋势相反，随温度下降而下降，且随温度下降，CAT活性不升反降，可能是枝条随温度下降，受冻严重且部分细胞死亡，酶含量下降活性降低。

在0 ℃时Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的CAT活性都为0，可能是此时酶活性较低，测试试剂盒检测灵敏度不够，故未测得CAT活性。但此时Ⅳ的CAT含量最高，为52 nmol/(min·g)，表明此温度下枝条已受到了冻害，CAT酶活性被激发出来清除低温产生的活性氧伤害。温度下降到-10 ℃时，Ⅲ的CAT活性高于I和Ⅱ，此时酶活性为Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ。当温度下降到-20 ℃时，Ⅲ变化趋缓，而I的CAT活性明显增加。Ⅱ在0～-30 ℃之间CAT含量上升较平缓，一直处于较低水平。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的CAT活性在-30 ℃达到峰值，分别为21 nmol/(min·g)、19 nmol/(min·g)和25 nmol/(min·g)，表明此温度下低温对其伤害加重，枝条的CAT活性被完全激发抵抗冻害，枝条有较好的抗寒性能。

2.3 低温对核桃1 a生枝条POD活性的影响

过氧化物酶(POD)是协同SOD和CAT，共同清除自由基的酶。核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下POD活性变化情况见图3。

图3 核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下POD活性变化Figure 3 Changes of POD activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由图3可知，4个品种(系)1 a生枝条随温度下降POD活性变化与SOD和CAT基本一致，也呈现2种不同的趋势。I、Ⅱ和Ⅲ的POD活性随温度下降呈现升-降-升的趋势。而Ⅳ呈现出相反的变化趋势，为降-升-降。

在0 ℃时，I、Ⅱ和Ⅲ的POD活性均为25 U/(g·min)，高于Ⅳ19 U/(g·min)。I、Ⅱ和Ⅲ的 POD活性在-10 ℃时出现最高值，分别为33 U/(g·min)、32 U/(g·min)和33 U/(g·min)。而Ⅳ的POD活性最高值出现在-20 ℃时，为34 U/(g·min)，活性最低值为-30℃时，9 U/(g·min)。

2.4 低温对核桃1 a生枝条MDA活性的影响

丙二醛含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现。丙二醛含量高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。一般植物在逆境条件下，如高温、盐碱以及强光等逆境条件下就会产生膜质过氧化。核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下MDA含量变化情况见图4。

图4 核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下MDA含量变化Figure 4 Changes of MDA content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由图4可知，4个核桃品种(系)1 a生枝条的MDA含量变化趋势一致，均为随温度下降而先升后降，变化趋势为缓-急-平。在-10 ℃至-20 ℃时，MDA含量呈现明显增加。4个核桃品种(系)的峰值均为-20 ℃时，分别为43 nmol/g、44 nmol/g、40 nmol/g和45 nmol/g。在各个温度下4个核桃品种(系)均表现为Ⅳ>Ⅱ> Ⅰ >Ⅲ。

2.5 低温对核桃1 a生枝条可溶性糖含量的影响

可溶性糖是维持细胞稳定性的指标，可溶性糖含量越高，细胞越不易失水，抗性越强。核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下可溶性糖含量变化情况见图5。

图5 核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下可溶性糖含量变化Figure 5 Changes of soluble sugar content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由图5可知，随温度下降，4个核桃品种(系)1 a生枝条呈现2种不同的变化趋势，其中I、Ⅱ和Ⅳ变化趋势一致，为降-升-降。而Ⅲ则呈现先升后降的趋势。

不同的低温处理对4个核桃品种(系)1 a生枝条的可溶性糖含量的影响不大，变化范围在20～42 μg/g之间，多数集中于25～35 μg/g之间。表明随着温度的降低，可溶性糖含量变化在相对小的范围内变化。在0 ℃时Ⅱ可溶性糖含量最高，为42 μg/g。I和Ⅲ分别在-20 ℃和-10 ℃含量达到峰值，分别为35 μg/g和36 μg/g。在各温度下，Ⅳ含量均显著低于其余各品种。

2.6 低温对核桃1 a生枝条可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白可以作为渗透调节物质使细胞维持一定的膨压，保证植物气孔运动和光合作用等生理过程的正常进行。核桃 1 a生枝条在不同温度胁迫下可溶性蛋白含量变化情况见图6。

图6 核桃1 a生枝条在不同温度胁迫下可溶性蛋白含量变化Figure 6 Changes of soluble protein content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由图6可知， 4个核桃品种(系)1 a生枝条变化趋势基本一致，在0～-30 ℃之间呈现降-升-降的变化趋势，仅Ⅲ在0～-10 ℃之间呈微弱的上升趋势。各品种(系)可溶性蛋白含量均在-20℃达到峰值。

在0 ℃时，可溶性蛋白含量为Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ，而在其余温度时，均为Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ。在低温胁迫下，Ⅲ的可溶性蛋白含量增幅最大，说明其对低温应激反应最强。其次依次为Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ。Ⅳ可溶性蛋白含量随温度下降变化幅度最小，仅为14 μg/g，表现为对温度胁迫较不敏感。

3 结论

赞核1号、赞核2号、辽宁1号和清香4个核桃品种(系)在0 ℃、-10 ℃、-20 ℃和-30 ℃下，保护酶(POD、CAT、SOD等)和渗透调节物质(如可溶性糖和可溶性蛋白等)变化不尽相同。呈现出2类变化趋势：第1类为赞核1号、赞核2号、辽宁1号变化趋势相同，且与清香变化趋势相反。具体表现在负载清除自由基，保护细胞膜完整性的SOD、POD和CAT活性上。其中SOD和POD呈现相同的变化规律，均为赞核1号、赞核2号和辽宁1号随温度下降表现为升-降-升的变化趋势，而清香变化趋势与其变化相反。CAT活性随温度的变化也呈现2种不同的变化趋势，同样为赞核1号、赞核2号和辽宁1号变化相同，随温度下降而酶活性上升，清香的变化趋势则相反，随温度下降而下降。第2类为4个核桃品种(系)变化趋势相同，表现在渗透调节物质的MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量上。其中4个核桃品种(系)的MDA含量均随温度温度下降而上升，而可溶性蛋白含量呈现随温度下降而降-升-降。4个核桃品种(系)可溶性糖含量呈现大体一致的变化趋势，含量随温度下降呈现降-升-降，仅在0 ℃到-10 ℃时，辽宁1号呈现轻微上升趋势。

对比4个核桃品种(系)各酶活性和物质含量可见，赞核1号和赞核2号多介于辽宁1号和清香之间，且赞核2号数值趋近于辽宁1号，而赞核1号数值多趋近于清香，但赞核1号和赞核2号数值差异极小。由此可推断出，赞核系列抗寒性介于辽宁1号和清香之间。且赞核系列酶活性和物质含量与辽宁1号变化趋势较为相似，而与清香变化差异较大，表现出赞核系列有良好的抗寒性能。