西昌地区猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性检测

曾梅，徐树培，张敏，李思聪，王斌，吴让忠

（1.四川省木里县动物疫病预防控制中心，四川 木里 615899；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

大肠杆菌是人和动物肠道共生菌群的组成部分，部分致病性大肠杆菌能引起人和动物腹泻、败血症等多种症状［1］。大肠杆菌在药物的选择压力下易产生耐药性，并可通过菌毛将耐药质粒传递给其他大肠杆菌，因而给大肠杆菌病的药物防控带来了较大的挑战［2］。当前大肠杆菌耐药及多重耐药现象日益严重，动物源耐药菌株可能会通过环境污染、动物源食品及与动物的接触传播给人类，导致公共卫生问题。本研究对四川西昌地区猪源样品进行了大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析，以期为合理使用抗生素提供依据。

1 材料

1.1 样本采集 无菌采集西昌地区21个猪场的病死猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结作为病料样本，置灭菌普通肉汤离心管中，送实验室进行细菌分离。

1.2 试剂、培养基和标准菌株 麦康凯琼脂、营养肉汤、MH琼脂、普通营养琼脂、药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂公司；标准菌株：大肠杆菌标准株ATCC 25922，购自中国兽药监察所。

1.3 实验动物 昆明系SPF小鼠，购自四川达硕生物技术有限公司。

2 方法

2.1 病料接种 无菌切取病变组织和正常组织交界处的小组织块置肉汤培养基中，37 ℃下进行24 h 增菌培养。然后蘸取增菌液划线于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，37 ℃纯化培养24 h。

2.2 菌落形态特征观察 伊红美蓝琼脂上出现黑棕色、棕绿色且带有金属反光的菌落，或出现中心黑点边缘呈灰白色的表面光滑的菌落；麦康凯琼脂上出现典型红色、粉红色的光滑菌落。采用16s rDNA PCR作进一步的分子鉴定。

2.3 16S rDNA PCR 测序鉴定［3］从伊红美蓝琼脂或麦康凯琼脂上挑取纯化后的典型单个菌落进行PCR 试验，扩增细菌16S rDNA 基因。引物为通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件：95℃5min；95℃1min；50 ℃1min，72 ℃2 min，共30 次循环；72 ℃延伸8 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，预扩增片段1 450 bp。PCR 产物由上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，序列结果用NCBI BLAST 搜索比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性试验［4］将鉴定了的猪源大肠杆菌接种到MH 琼脂平板，经37 ℃24 h 纯培养，用灭菌生理盐水洗下菌液，调整浑浊度与0.5 麦氏比浊管（1×108CFU/mL）相当，再分别腹腔注射小白鼠（0.2 mL/只），每株菌同时接种3只小鼠，并设标准株ATCC 25922 为对照，观察分离菌株对小鼠的致病性。

2.5 药敏试验 菌株于MH 肉汤中恒温（37 ℃）培养12 h后，用生理盐水稀释为0.5倍麦氏浓度，均匀涂布于MH琼脂平板。然后用药敏纸片分散器将药敏纸片均匀贴在琼脂平板表面，37 ℃恒温培养18 h后测量抑菌圈大小。

3 结果

3.1 细菌分离 从21 个猪场采集的106 份病料样本中分离到大肠杆菌28 株，分离率达26.4%。各个脏器的分离率分别为心脏7.1%（2/28），肺脏32.1%（9/28），淋巴结21.4%（6/28），肝脏7.1%（2/28），脾脏10.7%（3/28），肾脏21.4%（6/28）。

3.2 致病性试验 用分离出来的28株大肠杆菌攻毒小鼠，24 h内有6株导致1只小鼠死亡，14株导致2只小鼠死亡，8株导致3只小鼠死亡。从死亡小鼠的器官中也分离到了同种菌。对照组无死亡。

3.3 药敏试验 28 株大肠杆菌的药敏试验结果见表1。从表1 可知，本次临床分离菌对阿莫西林、氨苄西林、强力霉素、四环素、庆大霉素、复方新诺明的耐药性严重，耐药率高于85%，对阿米卡星和头孢喹肟保持较高的敏感性，耐药率分别为14.3%和10.7%。28株大肠杆菌全部表现为多重耐药，至少耐6种及以上受试药物，表明西昌地区猪源肠外致病性大肠杆菌的耐药性强、耐药谱广。

表1 28株大肠杆菌分离株的耐药性检测

4 讨论

4.1 本试验对西昌地区猪源大肠杆菌的耐药情况进行了检测分析。结果表明，所分离的28株大肠杆菌对阿莫西林、氨苄西林、强力霉素、四环素、庆大霉素、复方新诺明的耐药率高于85%。28株大肠杆菌全部表现为多重耐药，至少耐6种及以上受试药物，表明西昌地区猪源肠外致病性大肠杆菌的耐药性强、耐药谱广。

4.2 检测结果显示28株耐药大肠杆菌对头孢喹肟、阿米卡星敏感性较高，与2017年孔令汉等［5］、2015 年王斌等［6］报道的结果一致。阿米卡星耐药率低的主要原因可能与阿米卡星作为人医临床用药尚未允许在兽医临床使用有关，但值得关注的是，分离菌株中仍有14.3%对阿米卡星耐药，其耐药机制值得进一步研究。头孢喹肟为第四代动物专用头孢菌素，在我国兽医临床上的使用时间较短，故对分离菌具有较好的抑菌效果。

4.3 β-内酰胺类抗生素作为兽医和人医常用抗生素，其耐药性的发生发展不仅关系到畜禽健康养殖，而且对人医临床上的耐药性检测具有重要的参考价值。本试验分离的西昌地区21 个养殖场的28 株猪源大肠杆菌对阿莫西林、氨苄西林的耐药性高达90%以上，与王斌等［6］、曾博等［7］研究的结果相似。2013 年曾博等［7］曾报道其分离的79 株规模化猪场肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）对氨苄西林（耐药率为87.3%）、阿莫西林（耐药率为91.1%）的耐药性较强，对头孢噻呋（耐药率为7.6%）、氨苄西林/舒巴坦（耐药率为11.4%）、阿莫西林/棒酸（耐药率为16.4%）相对敏感。2015 年王斌等［6］报道其分离的40 株ExPEC菌株对氨苄西林（耐药率为92.5%）的耐药性较强，对氨苄西林/舒巴坦（耐药率为12.5%）、头孢克肟（耐药率为10.0%）表现出相对较好的敏感性。值得关注的是，近年来复方β-内酰胺酶抑制剂类抗生素和头孢类抗生素的耐药性有增加趋势，可能与这两类药物在临床中大量使用有关［8］。建议养殖户加强生猪养殖过程中的生物安全管理，通过药敏试验筛选敏感药物，做到精准用药、科学用药。