慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清microRNA-146a水平及其临床意义

王美华，陈丽琴

（杭州市西溪医院 1.呼吸内科，2.肺功能室，浙江 杭州 310023）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）为常见的呼吸道疾病，对人们的健康造成严重危害。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）是COPD 死亡的主要原因。AECOPD 由多种原因引起，呼吸道感染是导致AECOPD 发生的主要原因，呼吸道感染主要以细菌感染为主[1]。呼吸道感染可引起机体免疫炎症反应，导致血清免疫炎症细胞因子水平发生变化[2]。MicroRNA（miRNA）为一类非编码单链RNA，长度为20 ～23 个核苷酸，具有多种生理病理功能[3]。miRNA-146a 是一个可以调节免疫系统的miRNA，在免疫炎症反应中也发挥重要作用[4]。AECOPD 主要由呼吸道感染引起，但miRNA-146a 是否参与AECOPD 的发病过程尚不清楚。本文对AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平进行研究，探讨其在AECOPD 中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年1月—2019年12月在杭州市西溪医院就诊的150 例AECOPD 患者作为AECOPD 组，同期本院健康体检者150 例作为对照组。诊断标准： AECOPD 诊断参照《慢性阻塞性肺疾病全球倡议2019》[5]。纳入标准： ①AECOPD 患者符合AECOPD的诊断标准，入院前30 d 内未服用抗菌药物或糖皮质激素治疗，入院前7 d 未服用支气管扩张及影响研究结果药物；②对照组经胸片或胸部CT 检查无肺气肿、慢性支气管炎等肺部疾病表现；③均签署知情同意书。排除标准： ①活动性肺结核、支气管扩张、肺间质性疾病、支气管哮喘、气胸、胸膜粘连及胸腔积液等其他肺部疾病；②胸部CT 或胸片显示肺炎；③心肌梗死、心肌疾病、心力衰竭及风湿性心脏病等心脏疾病；④免疫性疾病；⑤糖尿病等内分泌疾病；⑥恶性肿瘤；⑦急慢性感染性疾病；⑧肺叶切除术病史；⑨严重心、肝、肾功能异常。本研究通过医院伦理委员会批准。两组性别、年龄、身高、体重指数（BMI）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而吸烟指数比较，差异有统计学意义（P＜0.05），AECOPD 组高于对照组。AECOPD 患者28 d 内死亡28 例，存活122 例。

表1 两组一般资料比较 （n =150）

1.2 方法

1.2.1 标本采集抽取AECOPD 患者和对照组体检者清晨空腹外周静脉血5 ml，5 200 r/min 离心10 min，取上层血清备用。

1.2.2 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）测定血清miRNA-146a 水平应用Trizol 法提取血清总RNA。将总RNA 逆转为cDNA，以U6 为内参，PCR 仪测定血清miRNA-146a 水平，PCR 反应条件： 94℃预变性10 min，94℃变性10 s，60℃退火1 min，45℃延伸1 min，共计42 个循环。血清miRNA-146a 水平以2-ΔΔct法表示。PCR 仪购自德国Analytikjena 公司，试剂购自丹麦EXIQON 公司。miRNA-146a 正向引物： 5'-GCTGAGAACTGAATTCCATGGGT-3'；反向引物为试剂盒通用引物，引物长度为25 bp。

1.2.3 血清C 反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、降钙素原（Procalcitonin,PCT）及白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）水平测定采用免疫速率散射比浊法测定CRP 水平；采用免疫层析法测定PCT水平；采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定IL-6水平。

1.2.4 肺功能测定采用德国耶格公司Master Screen肺功能仪测定患者肺功能，包括第一秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second,FEV1）和用力肺活量（forced vital capacity,FVC）。计算FEV1/FVC 值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Pearson 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比较

两组血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），AECOPD 组高于对照组。见表2。

表2 两组血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比较 （n =150，±s）

表2 两组血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比较 （n =150，±s）

组别 miRNA-146a CRP/（mg/L） PCT/（ng/ml） IL-6/（pg/ml）对照组 1.00±0.08 4.57±1.14 0.03±0.01 5.18±1.24 AECOPD 组 2.31±0.24 21.53±2.04 0.32±0.05 61.34±4.35 t 值 63.420 88.885 69.656 152.061 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 两组肺功能指标比较

两组FEV1、FVC 及FEV1/FVC 比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），AECOPD 组低于对照组。见表3。

表3 两组肺功能指标比较 （n =150，±s）

表3 两组肺功能指标比较 （n =150，±s）

组别 FEV1/L FVC/L FEV1/FVC/%对照组 1.77±0.22 3.48±0.37 74.98±9.02 AECOPD 组 1.18±0.17 2.41±0.46 52.35±8.67 t 值 25.990 22.199 22.153 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 不同临床特征患者血清miRNA-146a 水平比较

不同性别、年龄及是否戒烟患者血清miRNA-146a 水平比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；而不同肺功能分级患者血清miRNA-146a水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着肺功能分级升高，血清miRNA-146a 水平升高（P＜0.05）。死亡和存活患者血清miRNA-146a 水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），死亡患者高于存活患者。见表4。

表4 不同临床特征患者血清miRNA-146a 水平比较（±s）

表4 不同临床特征患者血清miRNA-146a 水平比较（±s）

因素 n miRNA-146a t/F 值 P 值性别男134 2.30±0.27 0.570 0.570女16 2.34±0.22年龄≥65 岁 82 2.30±0.28 0.664 0.508＜65 岁 68 2.33±0.27是否戒烟是92 2.29±0.32 0.579 0.563否58 2.32±0.29肺功能分级Ⅰ级 29 1.78±0.21Ⅱ级 45 2.14±0.25Ⅲ级 41 2.37±0.23Ⅳ级 35 2.58±0.24预后死亡 28 2.54±0.25 68.375 0.000 11.391 0.000存活 122 2.02±0.21

2.4 AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平与其他指标的相关性

AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平与血清CRP、PCT 及IL-6 水平呈正相关（P＜0.05）；而与FEV1、FVC 及FEV1/FVC 呈负相关（P＜0.05）。见表5。

表5 AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平与其他指标的相关性

3 讨论

COPD 的发生主要是由香烟烟雾或其他生物燃料产生的烟雾持续暴露所导致的肺部慢性炎症。慢性炎症产生肺气肿，阻止免疫机制和正常的修复过程，导致小气道纤维化。上述病理变化导致气流进行性受阻，出现呼吸困难等COPD 相关的临床症状。AECOPD是COPD 患者在受到感染或其他因素影响所导致的喘息、咳嗽及咳痰症状突然加重，肺功能急剧下降[6]。AECOPD 患者呼吸道感染可引起机体免疫炎症系统异常，免疫炎症反应在AECOPD 发病过程中发挥重要作用[7]。

miRNA-146a 在单核细胞、巨噬细胞及T 淋巴细胞等多种炎症和免疫细胞中高表达，是一种与炎症反应关系密切的miRNA[8-9]。研究发现，miRNA-146a 启动序列中含有核转录因子-κB（NF-κB）结合位点[10]。IL-6 等多种免疫炎症相关细胞因子通过NF-κB 依赖方式促进miRNA-146a 的表达。NF-κB 为参与炎症反应的主要信号通路，可反过来调节炎症和免疫反应[11-12]，如miRNA-146a 参与幼鼠细菌性脑膜炎的炎症反应过程[13]，miRNA-146a 参与癫痫大鼠炎症反应过程[14]。miRNA-146a 也通过免疫炎症反应参与肺损伤过程，改善miRNA-146a 的活性可以改善脂多糖诱导的肺部炎症反应，降低miRNA-146a 表达可保护COPD 诱导的肺损伤[15]。miRNA-146a 在COPD 中的作用也受到大家关注，ZHOU 等[16]研究发现，miRNA-146a 单核苷酸多态性影响COPD 患者的肺功能。CHEN 等[17]研究发现，循环中miRNA-146a 与COPD的炎症细胞因子有关，可预测COPD 急性加重的风险。

本研究发现，AECOPD 患者血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平升高，AECOPD患者血清miRNA-146a 水平与血清CRP、PCT 及IL-6 水平呈正相关，表明miRNA-146a 通过炎症反应参与AECOPD的发病过程。结合既往研究结果，分析AECOPD 患者CRP、PCT 及IL-6 等炎症细胞因子水平升高，炎症细胞因子激活NF-κB 等炎症相关信号通路，激活的NF-κB 与miRNA-146a 启动序列中含有NF-κB 结合位点，通过NF-κB 依赖方式促进miRNA-146a 的表达，导致miRNA-146a 水平升高，参与机体炎症反应过程，导致肺损伤。检测血清miRNA-146a 水平可在一定程度上反映AECOPD患者的机体炎症反应程度。

本研究显示，AECOPD 患者FEV1、FVC 及FEV1/FVC 值降低，AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平与FEV1、FVC 及FEV1/FVC 呈负相关，表明AECOPD 患者肺功能下降，miRNA-146a 水平在一定程度上可反映患者肺功能情况。本研究对不同临床特征AECOPD患者miRNA-146a 水平的研究结果显示，随着肺功能分级升高，血清miRNA-146a 水平升高，死亡患者血清miRNA-146a 水平高于存活患者，表明检测血清miRNA-146a 水平在一定程度上可反映AECOPD 患者的病情和预后。

综上所述，AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平升高，检测血清miRNA-146a 水平对评估患者机体炎症反应程度、肺功能、病情严重程度和预后具有一定的指导价值。