地龙提取物对百草枯诱导的肺纤维化模型小鼠炎症因子的影响

陈宏，张伟，郭建波，宋倩男，王伟明

(1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

纯品百草枯进入人体后，大部分可迅速被排泄到体外，但小部分经消化道吸收能够让患者中毒，并且对全身的器官产生影响,其中对肺和肾两个器官影响最大，且在这两个脏器中持续时间最长[1]。肺泡细胞(肺泡Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞)对百草枯具有主动摄取和蓄积特性，因此高浓度的百草枯会聚在肺和肾细胞中[2-3]，影响到脏器的功能运行，对其细胞破坏力强，从而导致肺和肾功能细胞坏死[4]。近期的药理研究表明,地龙能够解热，并且对支气管作用明显，可以抗纤维蛋白原，相关研究表明，地龙能够在一定程度上改变肺纤维化程度，特别是对于比较严重的患者，效果更明显。本研究主要观察和评价分析地龙提取物对百草枯(PQ)中毒模型小鼠肺纤维化的保护作用，并探讨其对肺纤维化模型小鼠炎症因子的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄SPF级雄性小鼠60只，体质量18～20 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。

1.2 药品与试剂

逆转录试剂盒[北京天根(TIANGEN)技术有限公司]；PCR引物(北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成)；百草枯(PQ)(上海沪联生物药业有限公司，200 g/L)；维生素C注射液(天津金耀药业有限公司，0.1 g/mL)；HE染色与Masson染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TGF-β1、IL-6、IL-17酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D公司)。

1.3 小鼠肺纤维化模型的建立及药物干预

40只小鼠随机分为4组，每组各10只，包括正常对照组、模型组、地龙提取物组及维生素C 组(100 mg/kg)。正常对照组小鼠进行蒸馏水灌胃，其余各组均采用PQ液体(100 mg/kg)一次性灌胃造模。并对地龙提取物组及维生素C组进行相应给药处理。

1.4 肺组织HE染色、Masson染色及评价

取小鼠右肺上叶，用4%中性甲醛固定，埋于石蜡中，切片，用HE和Masson染色。HE染色后肺组织按照Szapiel方法进行炎症评分，肺组织切片或小鼠炎症病理组。Masson染色后，胶原纤维的染色和绿面积百分比(绿染胶原面积/组织整体面积)的计算方法，在连续5个随机读取字段视觉软件进行计算，作为肺纤维化程度的半定量参数。

1.5 RT-PCR法检测

按照RT-PCR法检测方法，对各组的样本进行PCR试验，从而得到各组的相关RT-PCR检测结果，实验过程严格按照说明书进行。

1.6 ELISA检测TGF-β1、IL-6、IL-17 蛋白表达水平

按照ELISA 检测方法，对各组的TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表达水平,严格按照试剂盒上说明书进行操作，并得到数据，进行计算，得出各组的蛋白表达水平。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色及炎症评分

根据实验结果表明，造模后第7天和第14天，模型组小鼠肺组织出现大量炎性细胞浸润、肺泡间隔充血，炎症评分较正常对照组升高(P<0.05)，而地龙提取物组小鼠肺组织炎症评分较模型组和维生素C组降低(P<0.05)。见表1。

表1 各个时间点各组小鼠肺炎症评分比较分)

2.2 Masson染色及纤维化程度分析

造模后第14天，地龙提取物组小鼠肺组织纤维化程度较模型组降低(P<0.05)。同时与正常对照组比较，模型组和维生素C组小鼠肺组织纤维化程度也同时存在一定的差异(P<0.05)。见表2。

表2 各个时间点各组小鼠肺纤维化程度比较

2.3 TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表达水平比较

模型组TGF-β1、IL-6及IL-17蛋白表达的变化与其mRNA水平基本一致。造模后第14天，地龙提取物组TGF-β1蛋白表达水平较模型组降低(P<0.05)。在造模后第7天和第14天，地龙提取物组IL-6蛋白表达水平低于模型组，造模后第7天和第14天，地龙提取物组的IL-17蛋白表达水平均较模型组降低(P<0.05)。见表3。

表3 各个时间点各组小鼠TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表达水平比较

3 讨论

目前，肺纤维化的病因和发病机制尚不清楚，因此不可能进行有效的靶向治疗[5-7]。临床上以糖皮质激素和免疫抑制剂为基础的治疗方法占主导地位。肺部上皮细胞产生的白介素-8(Interleukin-8，IL-8)在肺纤维化中扮演了重要的角色[8]。另外相关文献中指出细胞内活性氧族群(Reactive oxygen species，ROS)、氧化压力和引发的下游信息传递在引发的肺部发炎中也非常重要，因此，若能有效减缓引起的肺部发炎和氧化压力，则可能改善慢性阻塞性肺部疾病的情况[9-10]。引发肺纤维化的病因有许多，包含了过敏原、化学物质、辐射以及环境中的微粒。肺泡组织损伤、肺部发炎以及氧化压力被认为是造成肺纤维化的主因[11]。肺纤维化的病程，是由于一连串的损伤、发炎和损伤位置的修复愈合过程中，单一或以上的步骤调节失控所导致的。在肺纤维化中一项主要现象为过多的促纤维化介质，如转化生长因子-β1(Transforming growth factor-1，TGF-β1)促使纤维母细胞转化成肌纤维母细胞，进而使胶原蛋白异常堆积[12-13]。

消除络脉之瘀浊，保持络脉气血通畅和肺络无损[14]，是治疗肺纤维化及肺系络脉病的关键。肺纤维化治疗过程中，化学药物的应用治疗效果不甚理想。因此，中医学的治疗或许能为肺纤维化的治疗提供新的选择。虽然地龙对肺纤维化治疗作用已有文献报道，但是对其药效研究尤其是在多种肺纤维化模型上的评价并没有系统研究[15]，此外，其治疗肺纤维化的分子机制也尚未被阐明，这一定程度上限制了该药物的在肺纤维化治疗上的应用。本研究结果显示，造模后第7天和第14天，模型组小鼠肺组织出现大量炎性细胞浸润、肺泡间隔充血，炎症评分较正常对照组升高，而地龙提取物组小鼠肺组织炎症评分较模型组和维生素C组降低。造模后第14天，地龙提取物组小鼠肺组织纤维化程度较模型组降低。模型组TGF-β1、IL-6及IL-17蛋白表达的变化与其mRNA水平基本一致。造模后第14天，地龙提取物组TGF-β1蛋白表达水平较模型组降低。在造模后第7天和第14天，地龙提取物组IL-6蛋白表达水平低于模型组，造模后第7天和第14天，地龙提取物组的IL-17蛋白表达水平均较模型组降低。因此，地龙提取物可通过抑制TGF-β1、IL-6和IL-17的表达来减轻PQ中毒造成的炎症反应和肺纤维化。