精液质量分析系统与血球计数板法测定精子密度方法误差来源分析

文│张小香 张士海（北京市昌平区畜牧水产技术推广站）

朱宽峰（北京田园奥瑞生物科技有限公司）

精液质量分析系统测定精子密度方法：在固定显微镜放大倍数和摄像头的情况下，摄像机的视野大小固定，以米尼图分析系统为例，20倍物镜下摄像头视野大小为563微米×563微米。此时采用厚度为20微米的精子计数板，则视野中精液体积为（0.563×0.563×0.02）毫米3＝6.34×10-6（毫升），计数多个全视野精子数求平均值x，则可计算出检测样品精子密度＝0.158x×106/毫升，再乘以稀释倍数则可计算出原始样品精子密度。

血球计数板法：计数5个面积为0.2毫米×0.2毫米，厚度为0.1毫米（中方格尺寸）区域的精子数x，然后可计算出精子密度＝x/（0.2×0.2×0.1×5）＝5x×104，再乘以稀释倍数即得到原始样品精子密度（图1）。

综上所述，以上两种方法的物理原理一样，都是通过固定计数范围和特定厚度计数室来规定抽样样品的体积，然后对规定范围内的精子进行计数，根据计数结果计算出单位体积的精子数，即精子密度。

这两种方法主要的不同之处在于，血球计数板法一般是由人工计数，而精液质量分析系统是由计算机计数。受限于人工计数能力，5个中方格精子数超过200就很难数了，这就要求更大的稀释倍数，并且只能检测不动的精子。而计算机计数一个视野几百个很正常，几个视野下来累计计数1000个以上很容易，并且能和精子活力同时检测，并且不用高倍稀释。计数数量小和高倍稀释会导致血球计数板法抽样误差更大，计算机检测相反。根据不重复抽样误差公式，从一支牛冻精约0.25亿总精子数中计数200个精子的抽样误差为u血＝Sx×［（1-200/2.5亿）/200］0.5＝0.071Sx，而计数1000个的抽样误差为u机＝Sx×［（1-1000/2.5亿）/1000］0.5＝0.032Sx，其中Sx表示样本标准差。可见计算机计数的抽样误差仅为血球计数板法的1/4～1/2。

◎图1 血球计数板计数室示意图

人工计数准确性更高，计算机计数要低一些，文献和实际经验显示，计算机识别准确率可达95%以上。

血球计数板法计数是在事先划好线的方格内，精液质量分析系统的计数范围是整个摄像头视野。由于边缘精子会导致精子无法被计算机识别，存在边缘精子识别误差。以米尼图分析系统为例，按精子一半落在视野外就不被识别计算，猪精子的头部长度为8微米，一半即为4微米，边缘区面积占视野总面积比例为（563×4×4-4×4×4）/5632=2.82%，精子落在此范围内的概率即为2.82%，即边缘精子识别导致的误差为2.82%。由于精子取向不同，上述情况只是误差最大的情形，因此是最大误差。最小误差情形是精子一半宽度在边缘外，猪精子宽约4微米此时误差为（563×2×2-2×2×4）/5632＝0.71%。即边缘误差在0.71%～2.82%，平均为1.76%。实际误差和精子与视野相对大小有关，精子越小，视野越大则边缘误差越小。

血球计数板计数室厚度为100微米，加工误差为1微米的情况下由厚度导致的误差为1%，而20微米的计数板则为5%，10微米的计数板则达到了10%。因此，在相同误差要求的情况下，计数室厚度越小，对加工精度要求越高，一次性的精子计数板均难以达到1微米的精度，据笔者经验，有的标称20微米的计数板实际可能只有16微米，误差达到20%。

由以上分析可知，血球计数板法主要的误差来自抽样误差，而精液质量分析系统的误差主要来自计数板加工精度和精子识别准确率。