耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药性和分子特征*

崔超琼，周义正，李承彬

湖北省荆州市中心医院医学检验部，湖北荆州 434020

临床上引起感染的细菌多为革兰阴性菌，尤其是肠杆菌科细菌。近年来，耐碳青霉烯肠杆菌科细菌(CRE)导致的感染不断增多，已对全球公共卫生健康构成严重威胁。CRE感染所带来的威胁主要表现在其高传播性、高耐药性和高病死率。最近2年本院CRE感染病例呈不断增多的趋势。为遏制该趋势和精准防控CRE流行，本研究以本院近2年来分离的CRE菌株为研究对象，对其流行特点、耐药现状和分子型别等方面展开研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1标本来源 收集荆州市中心医院2017年1月至2019年5月临床标本中分离的91株CRE，剔除同一患者相同部位重复分离的菌株，分离自痰40株，尿液17株，分泌物12株，血液10株，胸腔积液、腹水5株，胆汁4株，组织培养2株，脑脊液1株。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，碳青霉烯酶表型筛选试验质控株为大肠埃希菌ATCC BAA-2469、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705(阴性质控株)、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706(阳性质控株)。

1.2仪器与试剂 Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)、ABI 7500 PCR仪(美国ABI公司)、PowerPac 3000 电泳仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)、BioDoc-It2Imager凝胶成像系统(美国UVP公司)。胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB,杭州滨和微生物试剂公司)、细菌基因组DNA快速抽提试剂和Sangon Bitech扩增试剂盒(上海生工生物工程上海股份有限公司)、Marker DNA2000(大连宝生物工程有限公司)、E-test 条(法国生物梅里埃公司)。

1.3菌株保存 将临床标本按照《全国检验技术操作规程(第4版)》[1]的要求进行接种培养，使用Vitek 2 Compact全自动微生物系统鉴定细菌和药敏试验，选取目标菌落，用无菌滤纸刮取血平板上分纯的菌落，置于EP管中，-70 ℃低温冰箱保存。

1.4菌株复苏、鉴定和药敏试验 将保存的CRE菌株转种于血琼脂平板，复苏成功的细菌经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行细菌鉴定复核。用 Vitek 2 Compact 配套 AST-GN16药敏卡进行药敏试验；用E-test法复测亚胺培南和厄他培南的最低抑菌浓度(MIC)。药敏结果按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2018[2]标准判读。

1.5碳青霉烯酶表型筛选试验 根据CLSI 2018[2]指南进行改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)和乙二胺四乙酸改良碳青霉烯灭活试验(eCIM)。筛选产碳青霉烯酶菌株，仅在mCIM阳性时，eCIM阳性结果才有效，反之，eCIM试验阳性结果不作解释。

1.6耐药基因检测 引物序列查阅文献[3-5]获得，由上海生工生物工程上海股份有限公司合成引物。CRE菌株DNA提取参照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒操作，扩增碳青霉烯酶基因、ESBLs基因、膜孔蛋白基因及毒力基因，PCR反应体系为50 μL，包括25 μL 2×San Taq PCR Mix，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10 μmol/L)2 μL，灭菌水20 μL，DNA模板1 μL，基因退火温度及循环次数见表1,预变性92 ℃10 min，变性92 ℃ 1 min，退火1 min，延伸72 ℃ 1 min，继续延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。再经琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的特异性，并进行相应的测序分析。

表1 PCR扩增引物序列信息

续表1 PCR扩增引物序列信息

1.7多位点序列分型(MLST) 耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌MLST 根据数据库http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html中的引物和标准操作条件扩增gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB 7个管家基因；耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌MLST根据数据库http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli标准操作扩增adK、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA7个管家基因；耐碳青霉烯类药物阴沟肠杆菌MLST根据数据库https://pubmlst.org/ecloacae/标准操作扩增dnaA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rplB和rpoB7个管家基因;扩增产物测序结果上传至上述网页比对，查询得到对应等位基因型和ST型。

1.8统计学处理 数据分析采用WHONET5.6和SPSS23.0软件，计数资料采用χ2检验比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRE菌株药敏结果 91株CRE菌株中，重症监护室(ICU) 27株、外科27株、内科17株、儿科15株、其余科室5株。菌种分布中，肺炎克雷伯菌42株，植生克雷伯菌3株，解鸟氨酸克雷伯菌1株，大肠埃希菌23株，阴沟肠杆菌15株，弗氏柠檬酸杆菌3株，摩根摩根菌3株，奇异变形杆菌1株。受试菌对18种抗菌药物高度耐药，其中对替加环素敏感性最高(94.5%)，其次为阿米卡星(62.6%)、复方磺胺甲噁唑(36.2%)，对其余抗菌药物敏感性均低于30.0%。阴沟肠杆菌对环丙沙星和左氧氟沙星的敏感性高于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。有73.9%的大肠埃希菌对阿米卡星敏感，而60.0%的阴沟肠杆菌和52.3%的肺炎克雷伯菌对阿米卡星敏感。见表2。

表2 CRE菌株抗菌药物敏感结果(%)

2.2mCIM和eCIM联合检测结果 68株碳青霉烯酶基因阳性菌株中，66株mCIM结果阳性，23株碳青霉烯酶基因阴性菌株，mCIM结果均为阴性，mCIM筛选产碳青霉烯酶菌株的灵敏度为97.1%，特异度为100.0%。53株金属β-内酰胺酶基因阳性菌中，50株eCIM结果阳性；38株金属β-内酰胺酶基因阴性菌中，eCIM结果均为阴性，则eCIM筛选产金属β-内酰胺酶的灵敏度为94.3%，特异度为100.0%。15株丝氨酸碳青霉烯酶基因阳性菌，eCIM结果均为阴性，76株丝氨酸碳青霉烯酶基因阴性菌中，70株eCIM结果阳性，则eCIM筛选产丝氨酸碳青霉烯酶的灵敏度为100.0%，特异度为92.1%。

2.3耐药基因检测结果 91株CRE菌株中，60株(65.9%)CRE携带1种碳青霉烯酶基因，其中耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌主要产KPC(28.5%)，耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌主要产NDM(73.9%)，耐碳青霉烯类药物阴沟肠杆菌主要产NDM(53.3%)。8株(8.8%)CRE菌株合并2种碳青霉烯酶基因，3株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌中，2株携带NDM和IMP基因，1株携带NDM和OXA-48基因；1株耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌携带KPC和NDM基因；2株耐碳青霉烯类药物阴沟肠杆菌携带NDM和VIM基因；1株耐碳青霉烯类药物解鸟氨酸克雷伯菌和1株耐碳青霉烯类药物植生克雷伯菌均携带KPC和VIM基因。25.3%的CRE菌株碳青霉烯酶基因阴性。97.6%的耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌携带ESBLs基因，其余细菌100.0%携带ESBLs基因。42株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌毒力基因检测中，仅有1株检出毒力基因wcaG(2.4%)。见表3。

表3 PCR扩增结果(n,%)

2.4MLST结果 42株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌MLST有4类，其中ST11型12株，ST37型8株，ST17型8株，ST147型2株，ST48型1株，未分型11株。23株耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌MLST主要是ST167型17株，未分型6株。15株耐碳青霉烯类药物阴沟肠杆菌MLST有4类，其中ST418型6株，ST93型4株，ST74型2株，ST175型1株，未分型2株。

3 讨 论

碳青霉烯类抗菌药物对厌氧菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌引起的临床感染均有一定的疗效，被广泛用于重症感染患者的治疗，因高频率和不合理地使用抗菌药物，CRE逐渐增多。中国细菌耐药监测网数据表明，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药率已达10.1%[6]。本院分离的CRE中主要是肺炎克雷伯菌(42株)，其次是大肠埃希菌(23株)和阴沟肠杆菌(15株)；菌株多来源于ICU和外科，此类患者免疫力差，抵抗力低，因此ICU和外科是本院CRE防控的重点。CRE呈现严重的多重耐药现象，药敏结果显示，CRE对头孢唑啉和氨苄西林耐药率均为100.0%，仅对替加环素和阿米卡星敏感性较高，这与其他报道一致[7]。针对CRE感染的治疗具有挑战性，应根据药敏结果、耐药分子类型、感染严重程度和患者健康状况，选取有效的治疗方案。2018版CLSI指出mCIM与eCIM联合检测的灵敏度>95.0%，特异度>92.0%。本研究中筛选丝氨酸碳青霉烯酶和金属β-内酰胺酶的灵敏度和特异度与之一致，mCIM检测产碳青霉烯酶菌株操作简便，成本低，灵敏度和特异度高，一般临床微生物均可实施操作[8]。与eCIM联合检测可筛选产碳青霉烯酶类型，对临床用药具有指导意义。

本研究结果显示，本院主要流行的碳青霉烯酶类型为NDM、IMP和KPC。王素梅等[9]的研究结果中，KPC和VIM为主要碳青霉烯酶类型；河南部分地区和海南省5家综合医院收集的CRE菌株中，主要的耐药基因型均为NDM[10-11]。本次研究中，KPC的检出率低于NDM；91株CRE菌株中，仅有1株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌检出OXA-48基因，但国外报道的产OXA-48类碳青霉烯酶的耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌较多[12]。需要关注的是，本研究中检出8株携带2种碳青霉烯酶基因的CRE菌株，提示菌株出现多种耐药基因共存的情况。

本研究中，25.3%的CRE菌株不产碳青霉烯酶，而ESBLs耐药基因检出率为100.0%，因此这23株不产碳青霉烯酶的CRE菌株的耐药机制为高产ESBLs且合并膜孔蛋白的缺失。耐碳青霉烯的高毒力黏液型肺炎克雷伯菌，具有高耐药和高致病性的特点。毒力基因检测结果中，仅有1株肺炎克雷伯菌检出wcaG基因，其余毒力基因均未检出，高毒力的肺炎克雷伯菌的耐药变异可能导致其毒性降低。

耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌主要流行的MLST分别为ST11型、ST167型和ST418型，产KPC酶的ST11型与我国流行克隆株的报道一致[13]。而国外研究报道的耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌中ST258型较多[14]。在其他报道中可见产NDM酶阴沟肠杆菌的MLST主要为ST93型[10]。本院耐药菌株分子型别较多，存在克隆多样性传播。CRE耐药机制复杂多样性，使得对多种抗菌药物表现出高度耐药，造成临床感染治疗困难，医院感染控制部门必须重视和加强CRE菌株的防控。

总之，本院CRE菌株对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制复杂，多种耐药基因并存，分子型别较多。临床医师应做好CRE监测和筛查工作，采取有效的医院控制措施，遏制CRE菌株在不同患者和不同区域间流行播散。