滇重楼地上部分化学成分研究

陶俊杰，杨 杰，闻晓东

（中国药科大学中药学院，天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京211198）

重楼是百合科（Liliaceae）重楼属（Paris）植物的总称，共有26 个种及14 个变种，广泛分布于欧亚大陆的热带至温带地区。我国分布有其中的20个种及数个变种，主要集中在西南各省区。重楼属植物药用历史悠久，早在《神农本草经》中就有记载，主治疔疮痈肿、蛇虫咬伤、跌扑伤痛等症［1-4］，是著名中成药云南白药、宫血宁胶囊的重要药物成分。现代药理研究表明，重楼所含有的甾体皂苷具有显著的止血作用［5-6］。滇重楼（Paris polyphyllavar. yunnanensis）是重楼药材的重要基源植物，各版药典均有收录，但由于长期掠夺式的采挖，缺乏保护，滇重楼的野生资源日益枯竭。与此同时，滇重楼每年都可再生的地上部分一直被认为是非药用部位而被丢弃。为了扩大滇重楼植物的药用资源，本研究对滇重楼地上部分的甾体皂苷类成分进行了研究，为充分利用重楼属植物资源提供科学依据。

从滇重楼地上部分90%乙醇提取物中共分离得到6 个甾体皂苷类化合物，利用MS、IR、UV、1D以及2D NMR 等波谱技术对其结构进行鉴定，分别为26-O-β-D-glucopyranosyl-kryptogenin-3-O-α-Lrhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）］-β-D-glucopyranoside（1），dioseptemloside G（2），polyphylloside III（3），chonglouoside SL-19（4），protodioscin（5），chonglouoside SL-5（6）。其中化合物1 为新化合物，化合物2为首次从重楼属植物中分离得到。对以上6 个化合物进行促血小板聚集作用以及细胞毒性评价，结果发现：6 个化合物均未表现出明显的促血小板聚集作用；化合物2、4对于结肠癌细胞HT29具有较强的细胞毒性。

1 材 料

1.1 仪器与试剂

Tensor 27光谱仪、Bruker Avance DRX-500/600核磁共振光谱仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1100 series 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Alltech 2000 ES 蒸发光散射检测器（美国Alltech 公司）；R-100 旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）；LBY-NJ4 型血小板聚集仪（北京泰利康信公司）；Multiskan FC 酶标仪、Forma 311 CO2细胞培养箱（美国赛默飞世尔公司）；D101-大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；MCI-GEL 精细分离填料（日本三菱化学公司）；ODS 柱色谱填料（日本YMC 公司）；薄层色谱硅胶板GF254及柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 药 材

滇重楼药材于2017 年8 月采自云南腾冲地区，由中国药科大学中药分析系王强教授鉴定为百合科（Liliaceae）重楼属Paris植物滇重楼Paris.polyphyllavar.yunnanensis的地上部分。药材标本保存于中国药科大学中药分析系。

1.3 动物与细胞株

SPF 级KM 小鼠，雄性，体重（25±5）g，由南京青龙山动物繁殖中心提供，合格证号：SCXK（苏）2017-0001。人结肠癌细胞株HT29（上海中科院细胞库）。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 提取与分离

滇重楼药材10 kg，用90%乙醇回流提取4 次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至3 L，用水饱和正丁醇液萃取4 次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇至干，得滇重楼地上部分正丁醇萃取部位。取该部位100 g 进行D-101 大孔树脂柱色谱分离（乙醇-水），得到乙醇30%、50%、70%及90% 4 个洗脱部位。70%和90%两个部位合并后进行硅胶柱色谱分离（二氯甲烷-甲醇20∶1→1∶1），洗脱液根据薄层色谱（TLC）检测结果合并、浓缩，共得到9个洗脱部位：1-9。取部位9（CM 3∶1）再进行硅胶柱色谱分离（二氯甲烷-甲醇，10∶1→1∶1），共得到5个洗脱部位：9-1-9-5，取部位9-4（CM 3∶1）进行MCI 柱色谱分离（甲醇-水20%→100%），收集甲醇30%、50%、70% 3 个洗脱部位，3 个部位再进一步经反相硅胶柱色谱反复分离（丙酮/甲醇-水），最后经过制备HPLC 纯化（乙腈-水），其中30%部位得到化合物1（27 mg）、3（13 mg）、4（28 mg），50%部位得到化合物5（42 mg），70%部位得到化合物2（17 mg）、6（9 mg）。化合物1～6的结构式见图1。

3 结构鉴定

化合物1 白色无定形粉末，HR-ESI-MSm/z1 191.579 8 ［M-H］－（Calcd. for C57H91O26，1 191.573 3），确定化合物1 的分子式为C57H92O26，不饱和度为12。［α］-254.1°（c0.30，MeOH）；UV（MeOH）λmax255（lgε3.22）nm；IR（KBr，ν）：3 420，1 734，1 040 cm-1。13C NMR（C5D5N，150 MHz）共显示出57 个碳原子信号，其中包括5 组六碳糖单元信号和一组27个碳信号的苷元部分。结合1H NMR（600 MHz，C5D5N）以及HSQC 图谱分析发现，化合物1 的苷元部分具有4 个甲基结构［δH0.71（3H，s），δC13.7；δH1.07（3H，d，J= 6.0 Hz），δC16.5；δH1.02（3H，d，J= 6.5 Hz），δC18.3 以及δH1.07（3H，s），δC20.2］，10 个亚甲基结构，2个羰基碳原子［δC214.6；219.2］以及一对双 键 碳 原 子［δC122.3，δH5.32（1H，m），δC141.7］。对比已知化合物anguivioside XV［7］苷元部分的波谱数据，确定化合物1 的苷元为kryptogenin（3α，26-dihydroxycholest-5-ene16，22-dione）。在1D NMR 以及HSQC 谱中，可以观察到5 个糖分子的端基碳信号及其对应的质子［δH4.92（1H，d，J= 6.2 Hz），δC101.0；δH6.39（1H，br. s），δC102.9；δH5.83（1H，br. s），δC103.0；δH6.28（1H，br. s），δC103.9；δH4.86（1H，d，J= 7.9 Hz），δC105.4］，以及位于高场区的3 个糖链甲基碳及其对应的质子［δH1.60（1H，d，J=5.8 Hz），δC19.4；δH1.60（1H，d，J=5.6 Hz），δC19.6以及δH1.78（1H，d，J= 6.0 Hz），δC19.2］，通过与已知化合物anguivioside XV 糖链部分比较，推测化合物1 的糖链由3 分子L-鼠李糖及2 分子D-葡萄糖构成，由葡萄糖分子端基氢的偶合常数确定葡萄糖分子端基碳的构型为β型，鼠李糖端基碳构型由其C-5 的化学位移确定为α型［8］。HMBC 谱中观察到δH6.28（Rha Ⅲ-H-1）与δC81.0（Rha Ⅱ-C-4）、δH5.83（Rha Ⅱ-H-1）与δC78.3（Glc Ⅰ-C-4）、δH6.39（Rha Ⅰ-H-1）与δC78.9（Glc Ⅰ-C-2）、δH4.92（GlcⅠ-H-1）与δC79.0（C-3）存在相关信号，说明RhaⅢ连接在Rha Ⅱ的4 位，Rha Ⅱ连接在Glc Ⅰ的4 位，Rha Ⅰ连接在Glc Ⅰ的2 位，Glc Ⅰ连接在苷元的3 位上；另外，δH4.86（Glc Ⅱ-H-1）与δC75.9（C-26）相关，表明Glc Ⅱ连接在苷元的26 位碳原子上。

Figure 1 Chemical structures of compounds 1-6

其他HMBC、HSQC 以及1H-1H COSY 谱图（图2）进一步证实了对化合物1 的结构推测。综合上述分析，将化合物1 的结构鉴定为26-O-β-D-glucopyranosyl-kryptogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1-4）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）］-β-D-glucopyranoside。 化 合 物1 的1H NMR和13C NMR波谱数据全归属见表1。

化合物2 白色无定形粉末，ESI-MS（m/z）907.4［M+Na］+，分 子 式C45H72O17。1H NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.71（3H，d，J=5.5 Hz，CH3-27），0.90（3H，s，CH3-18），1.04（3H，s，CH3-19），1.18（3H，d，J=7.0 Hz，CH3-21），1.65（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-Rha I），1.77（3H，d，J=6.5 Hz，CH3-Rha II），4.99（1H，d，J= 7.2 Hz，Glc-H-1），5.87（1H，br.s，Rha II-H-1），6.40（1H，br. s，Rha I-H-l），5.71（1H，br. s，H-6）；13C NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.78（C-1），30.45（C-2），78.37（C-3），39.06（C-4），141.92（C-5），129.20（C-6），73.03（C-7），41.30（C-8），49.11（C-9），37.58（C-10），21.70（C-11），40.39（C-12），41.46（C-13），56.87（C-14），35.69（C-15），82.11（C-16），63.03（C-17），16.88（C-18），19.32（C-19），42.55（C-20），15.58（C-21），109.67（C-22），32.25（C-23），29.76（C-24），31.11（C-25），67.31（C-26），17.79（C-27），Glc：100.78（C-1′），78.37（C-2′），78.37（C-3′），79.11（C-4′），77.40（C-5′），61.78（C-6′），Rha I：102.56（C-1″），72.98（C-2″），73.34（C-3″），74.61（C-4″），69.94（C-5″），18.97（C-6″），Rha II：103.39（C-1‴），72.98（C-2‴），73.13（C-3‴），74.40（C-4‴），70.90（C-5‴），19.10（C-6‴）。以上数据与文献报道［9］的数据基本一致，故化合物2鉴定为dioseptemloside G。

Figure 2 Key HMBC, 1H-1H COSY correlations of compound 1

化合物3 白色无定形粉末，ESI-MS（m/z）1 069.4［M+Na］+，分 子 式C51H82O22。1H NMR（C5D5N，500 MHz）δ：1.00（3H，s，CH3-18），1.11（3H，s，CH3-19），1.27（3H，d，J= 7.0 Hz，CH3-21），1.62（3H，d，J= 5.0 Hz，CH3-Rha I），1.62（3H，d，J= 5.5 Hz，CH3-Rha II），1.78（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-Rha III），4.92（1H，br. s，Glc-H-1），5.83（1H，s，Rha II-H-1），6.28（1H，s，Rha III-H-1），6.39（1H，s，Rha I-H-l）；13C NMR（C5D5N，125 MHz）δ：36.76（C-1），29.36（C-2），77.28（C-3），38.19（C-4），139.99（C-5），121.02（C-6），31.27（C-7），31.55（C-8），49.46（C-9），36.35（C-10），20.15（C-11），31.55（C-12），44.35（C-13），52.23（C-14），32.8（C-15），89.24（C-16），89.36（C-17），16.34（C-18），18.63（C-19），44.07（C-20），8.93（C-21），109.40（C-22），31.27（C-23），22.78（C-24），38.16（C-25），63.12（C-26），63.58（C-27），Glc：99.49（C-1′），79.56（C-2′），76.14（C-3′），77.28（C-4′），76.91（C-5′），60.42（C-6′），Rha I：101.35（C-1″），72.08（C-2″），71.67（C-3″），73.31（C-4″），68.73（C-5″），17.58（C-6″），Rha II：101.42（C-1‴），72.44（C-2‴），72.01（C-3‴），77.20（C-4‴），67.53（C-5‴），17.80（C-6‴），Rha III：102.46（C-1），72.00（C-2），71.80（C-3），73.18（C-4），69.58（C-5），18.04（C-6）。以上数据与文献报道［10］的数据基本一致，故化合物3鉴定为polyphylloside III。

化合物4 白色无定形粉末，ESI-MS（m/z）1 053.2［M+Na］+，分 子 式C51H82O21。1H NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.73（3H，s，CH3-18），1.08（3H，d，J= 8.0 Hz，CH3-21），1.09（3H，s，CH3-19），1.14（3H，d，J= 7.0 Hz，CH3-27），1.62（3H，d，J= 3.0 Hz，CH3-Rha I），1.62（3H，d，J=3.0 Hz，CH3-Rha II），1.79（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-Rha III），4.97（1H，d，J=6.0 Hz，Glc-H-1），5.84（1H，s，Rha II-H-1），6.29（1H，s，Rha III-H-1），6.40（1H，s，Rha I-H-l）；13C NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.25（C-1），30.16（C-2），78.07（C-3），38.97（C-4），140.97（C-5），121.48（C-6），32.00（C-7），31.04（C-8），50.05（C-9），37.10（C-10），20.78（C-11），38.72（C-12），41.72（C-13），51.18（C-14），37.44（C-15），217.69（C-16），66.42（C-17），12.88（C-18），19.41（C-19），43.79（C-20），15.64（C-21），213.28（C-22），40.41（C-23），27.69（C-24），36.22（C-25），67.48（C-26），17.28（C-27），Glc：100.40（C-1′），78.05（C-2′），77.91（C-3′），77.76（C-4′），77.04（C-5′），61.32（C-6′），Rha I：102.21（C-1″），72.52（C-2″），72.88

（C-3″），74.17（C-4″），69.57（C-5″），18.44（C-6″），Rha II：102.28（C-1‴），72.88（C-2‴），73.30（C-3‴），80.42（C-4‴），68.39（C-5‴），18.67（C-6‴），Rha III：103.32（C-1），72.66（C-2），72.94（C-3），74.03（C-4），70.43（C-5），18.90（C-6）。以上数据与文献报道的数据［11］基本一致，故化合物4 鉴定为chonglouoside SL-19。

Table 1 1H NMR(600 MHz,C5D5N)and 13C NMR(150 MHz,C5D5N)spectral data of compound 1(J in Hz)

化合物5 白色无定形粉末，ESI-MS（m/z）1 071.5［M+Na］+，分 子 式C51H84O22。1H NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.88（3H，s，CH3-18），1.01（3H，d，J=7.0 Hz，CH3-27），1.07（3H，s，CH3-19），1.35（3H，d，J= 7.0 Hz，CH3-21），1.65（3H，d，J= 6.0. Hz，CH3-Rha I），1.78（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-Rha II），4.83（1H，d，J= 8.0 Hz，Glc I-H-1），4.93（1H，d，J= 7.0 Hz，Glc II-H-1），5.88（1H，s，Rha II-H-1），6.42（1H，s，Rha I-H-l），5.32（1H，br. s，H-6）；13C NMR（C5D5N，125 MHz）δ：38.00（C-1），30.66（C-2），78.26（C-3），39.48（C-4），141.27（C-5），122.31（C-6），32.83（C-7），32.17（C-8），50.85（C-9），37.62（C-10），21.59（C-11），40.42（C-12），41.27（C-13），57.08（C-14），32.95（C-15），81.58（C-16），64.34（C-17），16.92（C-18），19.88（C-19），41.47（C-20），16.94（C-21），111.14（C-22），37.62（C-23），28.84（C-24），34.77（C-25），75.69（C-26），17.95（C-27），Glc I：100.79（C-1′），78.61（C-2′），77.41（C-3′），79.10（C-4′），78.26（C-5′），61.78（C-6′），Rha I：102.49（C-1″），73.01（C-2″），73.03（C-3″），74.62（C-4″），69.99（C-5″），18.97（C-6″），Rha II：103.39（C-1‴），73.01（C-2‴），73.21（C-3‴），74.40（C-4‴），70.90（C-5‴），19.11（C-6‴），Glc II：105.43（C-1），75.74（C-2），78.96（C-3），72.20（C-4），78.44（C-5），63.32（C-6）。以上数据与文献报道的数据［12］基本一致，故化合物5鉴定为protodioscin。

化合物6 白色无定形粉末，ESI-MS（m/z）1 051.4［M+Na］+，分 子 式C51H80O21。1H NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.69（3H，d，J= 5.0 Hz，CH3-27），0.86（3H，s，CH3-18），1.13（3H，s，CH3-19），1.15（3H，d，J=5.5 Hz，CH3-21），1.63（3H，d，J= 4.0 Hz，CH3-Rha II），1.63（3H，d，J=4.0 Hz，CH3-Rha I），1.78（3H，d，J=4.5 Hz，CH3-Rha III），4.92（1H，br. s，Glc-H-1），5.78（1H，br.s，H-6），5.87（1H，s，Rha II-H-1），6.32（1H，s，Rha III-H-1），6.46（1H，s，Rha I-H-l）；13C NMR（C5D5N，125 MHz）δ：36.91（C-1），30.22（C-2），77.60（C-3），39.31（C-4），165.66（C-5），126.75（C-6），201.48（C-7），45.48（C-8），50.28（C-9），39.18（C-10），21.57（C-11），39.18（C-12），41.65（C-13），50.46（C-14），34.84（C-15），81.81（C-16），62.36（C-17），16.93（C-18），17.53（C-19），42.40（C-20），15.61（C-21），109.76（C-22），32.29（C-23），29.70（C-24），31.06（C-25），67.26（C-26），17.77（C-27），Glc：101.05（C-1′），78.14（C-2′），78.04（C-3′），78.06（C-4′），77.49（C-5′），61.70（C-6′），Rha I：102.52（C-1″），72.95（C-2″），73.28（C-3″），74.58（C-4″），70.02（C-5″），19.12（C-6″），Rha II：102.72（C-1‴），73.34（C-2‴），73.78（C-3‴），80.88（C-4‴），68.82（C-5‴），19.37（C-6‴），Rha III：103.82（C-1），73.14（C-2），73.34（C-3），74.49（C-4），70.92（C-5），18.92（C-6）。以上数据与文献报道的数据［13］基本一致，故化合物6 鉴定为chonglouoside SL-5。

4 生物活性检测

4.1 促血小板聚集活性检测

血小板聚集的浊度测量参考Sun 等［14］的方法及仪器操作手册。用3.8%柠檬酸钠溶液抗凝，下腔静脉穿刺取小鼠血液。血液采集后用水平离心机500 r/min 转速离心5 min，待自然停止后取出，获得富血小板血浆（PRP），小心吸取上层富含血小板血浆后，将剩余的血液3 000 r/min 转速离心10 min，待自然停止后取出，获得血小板缺乏血浆（PPP），离心温度维持在22 ℃。对PRP 中的血小板进行计数后用生理盐水进行调整，将血小板浓度稀释到每升2×1011个。血小板聚集试验在制备PRP后3 h内完成。

在测定样品方杯中加入1 个小磁棒和PRP 300µL，置恒温孔中预热5 min，待仪器扣除背景且示数稳定后，用微量进样器吸取待测样品5 µL 加入杯底，记录血小板聚集引起的光密度变化。聚合的程度是根据透光率的最大增加百分比来估计的，血小板缺乏血浆表示100%的透光率。以生理盐水为空白对照，以重楼皂苷Ⅶ为阳性对照。

4.2 细胞毒性检测

取单层培养的HT29 细胞，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基配成每毫升5×104个细胞悬液后接种于96 孔板（每孔100µL），于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的条件下静置24 h，待细胞贴壁后分别加入不同浓度（1，5，10，25，50，100 µmol/L）的化合物1～6 及阳性药顺铂，并设空白组，同样培养条件下培养48 h 后，每孔加入MTT（5 mg/L）20µL 作用3 h，加入DMSO 溶解形成的蓝紫色结晶，并于492 nm 波长测定各孔细胞吸收度，并计算IC50。实验重复3次。

4.3 生物活性测定结果

采用血小板聚集仪对已经分离鉴定的6 个化合物进行促血小板聚集活性评价。研究结果表明，与空白对照组血小板最大聚集率（33.06%）相比，在20 mmol/L 浓度下，化合物1（31.93%）、2（33.34%）、3（30.28%）、4（31.26%）、5（34.19%）、6（36.16%）均未显示出明显的促进血小板聚集的作用；在相同浓度下，阳性对照重楼皂苷Ⅶ血小板最大聚集率为63%。

采用MTT 比色法对已分离鉴定的6 个化合物进行细胞毒性评价。研究结果表明，化合物2［IC50（6.215±1.016）µmol/L］、化合物4［IC50（17.750±1.304）µmol/L］对于人结肠癌HT29 细胞具有较强的细胞毒性，且化合物2的细胞毒性强于阳性药顺铂［IC50（11.145 ± 1.109）µmol/L］。其他4 个化合物的IC50超过100µmol/L，因此认为对该细胞株没有明显的细胞毒性。

5 结果与讨论

本研究对滇重楼（Paris. polyphyllavar.yunnanensis）地上部分的化学成分进行了初步研究，分离并鉴定了6 个化合物，其中包括1 个新化合物。同时发现分离得到的化合物2 和4 对HT29 细胞具有较强的细胞毒性，具有进一步研究的价值。本研究结果丰富了滇重楼的化学库，为其药用价值的开发利用提供了研究基础。但本研究对滇重楼地上部分的成分分离还不够全面，药理活性研究不够深入，亟待后续的进一步研究。