OjCHI真核表达载体的构建及农杆菌的遗传转化

徐 僡,高方平,郑远静,周娜娜,孙 威,2*

(1.贵州师范大学 生命科学学院/植物生理与发育调控重点实验室,贵州 贵阳 550025; 2.西南喀斯特山地生物多样性保护重点实验室,贵州 贵阳 550025)

0 引言

类黄酮化合物是一类重要的植物次生代谢产物，主要存在于高等植物中，在植物的果实、花朵、叶片中含量丰富[1-2]。类黄酮以丙二酰辅-CoA和香豆酰-CoA为前体物质，在多种酶的催化作用下形成黄酮醇、花色苷等一系列类黄酮物质。有研究显示，该类化合物具有参与植物的花色形成、紫外线辐射防护、抵抗病原体等[3-5]功能。此外，类黄酮化合物还与人类健康有着密切的关系，如：消除氧自由基、抗炎、抗癌、保护心脑血管系统等，同时类黄酮化合物在水果、蔬菜等经济作物中的含量也常作为衡量食品营养价值的重要指标之一[6]。查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)是类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶，它负责催化柚皮素查尔酮生成柚皮素，进而影响或改变类黄酮物质的合成[7-9]。因此，该基因常被用于改良植物的花色、叶色及类黄酮的种类与含量等。

日本蛇根草(Ophiorrhizajaponica)别称散血草、活血丹、蛇根藤等，属于茜草目茜草科蛇根草属的多年草本植物，中医认为日本蛇根草可全草药用，能够活血散瘀、清肺祛痰，同时还具有清热解毒、降压、治疗劳伤咳血、月经不调等功效[10-11]。早期关于日本蛇根草的研究主要集中在其药用价值方面，近年来本实验室已成功克隆得到多个参与日本蛇根草类黄酮合成的基因并完成了相关生物信息学分析，同时在此基础上对查尔酮异构酶基因也进行了深入研究，包括完成其原核表达载体的构建、制备并纯化获得可溶性重组蛋白等[12-18]。基于此，本实验在前期研究基础上，构建日本蛇根草查尔酮异构酶基因的真核表达载体pBI121-OjCHI，并将其转入农杆菌GV3101，以期为后续证明该基因在植物中的功能，以及茜草目植物类黄酮代谢与调控机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109，农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101由本实验室保存。

1.1.2 实验质粒

pMD18-T购自TaKaRa公司；pBI121由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂

Taq酶、核酸染色剂、DNA Marker、T4-DNA 连接酶；DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等。

1.2 实验方法

1.2.1 酶切位点的引入

基于前期所获OjCHI基因序列，利用生物软件PRIMER 5.0设计含有XbaI酶切位点的上游引物(CHI-F-121)和含有BamH I酶切的下游引物(CHI-R-121)，序列如下：

1.2.2 目的片段与克隆载体pMD18-T的连接

利用上述设计引物扩增目的片段，PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收具有XbaI和BamH I酶切位点的目的基因，并验证其大小及亮度是否符合要求。验证正确的胶回收产物与pMD18-T载体16 ℃过夜连接后，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，次日挑取单克隆进行菌液 PCR，筛选获得的阳性克隆接菌提取质粒并进行XbaI和BamH I双酶切验证，将验证正确的质粒送至武汉金开瑞生物工程有限公司测序，利用DNA MAN软件比对分析测序结果，同时将测序正确的质粒命名为T+CHI(X+B)。

1.2.3 目的片段与真核表达载体pBI121的连接

利用XbaI和BamH I限制性内切酶对重组质粒T+CHI(X+B)和真核表达载体质粒pBI121同时进行双酶切，30 ℃，酶切3 h。酶切后经0.8%琼脂糖凝胶电泳验证，切下大小正确的目的片段和载体片段进行回收并验证正确后，利用T4-DNA连接酶连接pBI121和T+CHI(X+B)胶回收产物，连接反应条件为16 ℃连接16 h。

1.2.4 pBI121-OjCHI真核表达载体的验证

将全部连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，用含Kan+抗性的LB平板固体培养基进行筛选；次日挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，挑选阳性克隆接菌提取重组质粒，并经XbaI和BamH I双酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性克隆质粒送测序并比对测序结果，将测序结果正确的重组质粒命名为pBI121-OjCHI。

1.2.5 转化

1)在超净工作台中，将连接16 h后的连接产物加入装有100 μL JM109感受态细胞的EP管中，轻轻混匀，将 EP 管插入冰中冰浴 30 min；

2)42 ℃热激60 s后，再冰浴 2 min；

3)在超净工作台中加入1 mL无抗液体培养基，并置于37 ℃恒温摇床中震荡培养1.5 h；

4)将培养1.5 h后的菌液置于高速离心机中3 700 rpm离心3 min，在无菌操作台中取100 μL上清重悬沉淀，涂布于Kan+抗性固体培养基平板上，并将平板倒置于37 ℃恒温培养箱培养。

2 结果与分析

2.1 CHI基因酶切位点的引入

根据OjCHI基因序列设计含有XbaI 和BamH I酶切位点的上下游引物，利用PCR扩增，使OjCHI基因的5’和3’端分别带上XbaI和BamH I酶切位点，电泳得到大小为702 bp左右的产物(见图1A)。产物经回收验证正确后(见图1B)，连接到pMD18-T克隆载体并转化JM109感受态，挑取单克隆进行菌液PCR后(见图1C)，提质粒并做酶切验证(见图1D)，将验证为阳性克隆的质粒命名为pMD18-T-OjCHI并送测序，测序比对正确，酶切位点引入成功，保存相应质粒及菌种。

注:A:M.DL2000 Marker;1,2.大量PCR结果;B:M.DL2000 Marker;1.胶回收CHI验证;C:M.DL2000 Marker;1,2.菌液PCR结果;D:M. Marker Ⅲ;1,2.pMD18-T-OjCHI质粒经Xba I和BamH I双酶切。图1 OjCHI基因酶切位点的引入及验证Fig.1 Introduction and verification of restriction site of OjCHI

2.2 真核表达载体的构建和鉴定

扩摇pMD18-T-OjCHI菌种并大量提取质粒，用限制性内切酶XbaI和BamH I进行大量酶切，同时对真核载体pBI121也进行大量酶切，分别进行胶回收(见图2A-B)，随后将目的片段与真核表达载体连接，转入JM109感受态细胞中过夜培养，随机挑取单克隆，进行菌液PCR验证，电泳发现在500～750 bp 处存在一特异性条带(见图2C)，与预计的条带大小一致。阳性克隆接菌扩摇后，提质粒经限制性内切酶XbaI 和BamH I双酶切验证(见图2D)。

注:A:M.Marker Ⅲ;1.胶回收pBI121验证;B:M.DL2000 Marker;1.胶回收CHI验证;C:M.DL2000 Marker;1-4.菌液PCR结果;D:M.Marker Ⅲ;1,2.pBI121-OjCHI质粒经Xba I和BamH I双酶切。图2 重组质粒pBI121-OjCHI 的构建及鉴定Fig.2 PCR product and restriction endonuclease analysis of plasmid pBI121-OjCHI

将初步验证为阳性的重组质粒送武汉金开瑞生物工程有限公司测序，测序结果与原始序列比对一致，未发生碱基突变或缺失，表明OjCHI基因已成功插入pBI121载体(见图3)。

图3 pBI121-OjCHI测序结果比对Fig.3 Comparison of pBI121-OjCHI sequencing results

2.3 重组质粒pBI121-OjCHI转化农杆菌GV3101

重组质粒pBI121-OjCHI利用冻融法转入GV3101感受态中，转化长出克隆后(见图4A)随机挑取其中的克隆进行菌液PCR(见图4B)，将验证正确的菌扩摇，利用质粒小提试剂盒提取质粒做酶切验证。如图4C显示，电泳结果中的条带大小与目的基因大小一致，但条带信号较弱，将阳性质粒送测序，测序结果与原始序列比对一致，表明重组质粒pBI121-OjCHI成功转入农杆菌GV3101感受态细胞中。

注:A:转化后克隆板;B:M.DL2000 Marker;1-4.菌液PCR结果;C:M.DL2000 Marker;1-4.pBI121-OjCHI质粒经Xba I和BamH I双酶切。图4 重组质粒pBI121-OjCHI 转化GV3101验证Fig.4 PCR product and restriction endonuclease analysis of plasmid pBI121-OjCHI in GV3101

3 讨论

类黄酮作为一类非常重要的植物次生代谢物，与植物的耐逆性、植物与环境因子之间的相互作用及植物体内激素的转运密切相关，同时它也是自然界中的一种天然的色素，具有多种药理活性，对人类健康起到促进作用，因此，现阶段该类化合物受到广泛关注[19-21]。查尔酮异构酶是类黄酮化合物代谢合成途径中的关键酶之一，它在类黄酮的合成与积累过程中发挥非常重要的作用。前期研究显示，根据进化关系可将查尔酮异构酶分为4种类型：一种是绝大多数植物所具有的Type I型CHI，它只能催化6’-羟基查尔酮转化为5-羟基黄烷酮；一种是豆科植物所特有的TypeⅡ型CHI，它能够以6’-羟基查尔酮和6’-脱氧查尔酮为底物，相应将其转化为5-羟基黄烷酮和5-脱氧黄烷酮；TypeⅢ型CHI不具有查尔酮催化活性，负责参与脂肪防酸的合成和储存；Type型ⅣCHI由于个别氨基酸的突变已使其完全丧失了CHI的活性，但其可作为增强子参与类黄酮的合成和积累[22]。笔者团队前期的研究显示，OjCHI属于Type I型CHI，具有典型CHI的活性，可为下一步酶活分析提供重要的参考[23]。

CHI属于多基因家族，不同的CHI结构变异较大，且其表达具有组织特异性和时空表达特异性[24]。目前，已从矮牵牛、沙梨、玉米、橙、草莓、雪莲等多种植物中成功克隆得到CHI基因。有研究证明，该基因的活性显著影响类黄酮化合物的积累以及植物组织着色[25-26]。如：康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、翠菊(C.ehinensis)的CHI基因受到抑制后，花色均变为黄色；洋葱CHI基因突变导致该酶失活，表皮变为金色；将牡丹CHI基因过表达载体导入烟草遗传转化体系后，检测出转基因烟草的总黄酮和黄酮含量比野生型的提高了3倍，但其花色苷含量和花色强度却明显降低[27-30]。而且，CHI基因还可与其它多种酶基因共同用于改变类黄酮的合成，如将CHI基因与CHS、DFR基因同时转入马铃薯，马铃薯中花色素苷等类黄酮化合物的含量得到提高，并且其抗氧化能力也得到改善[30]。

本实验在克隆获得日本蛇根草CHI基因的基础上，以双元质粒pBI121为基础构建OjCHI基因表达载体pBI121-OjCHI，并利用冻融法转入根癌农杆菌GV3101。植物表达载体pBI121上游带有烟草花叶病毒CaMV35S强启动子，构建PBI121-OjCHI植物表达载体并转入植物中能够增强OjCHI基因的表达，并且可通过 Kan+抗性筛选阳性植株[31]。因此，在后续实验中，试图利用叶盘转化法、蘸花法等对模式植物(矮牵牛、拟南芥等)进行转基因，获取阳性植株，初步验证该基因在植物中的功能，可为茜草目植物类黄酮代谢及花色改良研究提供参考，同时还可探索植物基因工程技术对中药材的改造。