响应面法优化藏药唐古特青兰中多糖的提取工艺

金建华,李永元,才项措

(青海民族大学 青藏高原资源化学与生态环境保护实验室,青海 西宁 810007)

0 引言

唐古特青兰(Dracocephalumtanguticum)，又名甘青青兰，为唇形科青兰属植物[1]，藏语名priyangku( 知羊格)，产于中国西藏、青海、四川和甘肃等地，生于海拔1 900～4 000 m的阳坡、干燥河谷、草滩、高山或松林林缘，是青藏高原特有植物，在藏药中用途甚广。藏医药典籍《晶珠本草》中记载：知羊格味甘、苦、清胆热、止血、愈疮、燥黄水，全草用于治疗黄疸型肝炎、胃炎、胃溃疡、气管炎、头晕、神疲、关节炎及疖疮等病症，具有清热利湿、止血、化痪止咳等功效[2-3]。唐古特青兰在改善缺氧造成的心、脑等组织的病理学损伤、降血糖、保肝、抗菌、抗病毒等方面有许多独到之处[4-5]。唐古特青兰主含黄酮甙、多糖、 挥发油、 氨基酸、 甾类、 齐墩果酸、熊果酸、 胡萝卜甙等化学成分，其中多糖是一类重要的生物活性物质，具有调节人体免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗缺氧、抗菌、抗病毒、保护肝脏等作用，且不会对生命体产生直接的毒害作用[6-7]。目前，提取各种植物多糖的方法较多[8-9]，主要为热水浸提取法和超声波辅助浸提取法。热水浸提取法工艺简单，提取的主要是胞外多糖，多糖提取率较低；超声波浸提取法多糖提取率较高，但长时间超声，对多糖分子结构有一定破坏作用。快速溶剂萃取-超声波辅助提取法是多糖提取的创新性工作，该方法具有浸提取时间短、对生物活性影响小、提取率高等优点，并在藏药活性成分提取研究方面初步得到了应用[10-11]。鉴于快速溶剂萃取-超声波提取唐古特青兰多糖的研究较为少见，本研究依据单因素试验结果，以多糖提取率作为响应值，选取多糖提取时间、提取温度、液料比等3个因素进行响应面分析法中Box-behnken试验设计[12-14]，对唐古特青兰多糖提取工艺进行优化，以期为藏药活性成分提取的研究提供新的思路。

1 研究方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：唐古特青兰药材采于青海省海西州都兰县，经青海某藏药业股份有限公司主管药师鉴定为唇形科青兰属植物唐古特青兰的带根全草，药材标本(编号TQT2018714)存放于青藏高原资源化学与生态环境保护实验室。将唐古特青兰样品清洗干净、阴干、粉碎过60目筛备用。

试剂：苯酚，D-无水葡萄糖标准品，浓硫酸，乙醇(95%)，氯仿、甲醇、正丁醇、中性蛋白酶、α-淀粉酶等均为分析纯。

仪器：FW-177中草药粉碎机；Beckman 高速离心机；RE-5002型减压浓缩蒸发仪；ASE-350型快速溶剂萃取仪；40-KHZ型超声波发生器；UV-2450 型紫外-可见分光光度计；AL204 电子天平。

1.2 试剂的配制

1.2.1 5%苯酚液的配制

称取5.0 g苯酚，加适量的蒸馏水使苯酚溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，摇匀即可。

1.2.2 葡萄糖标准溶液的配制

准确称取250 mg的葡萄糖于烧杯中，加入适量的蒸馏水，溶解后转移至250 mL棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为l mg/mL葡萄糖标准溶液。

1.3 试验方法

1.3.1 最大吸收波长选择

精确移取葡萄糖标准溶液0.2 mL，加入新配制的1.0 mL 5%苯酚溶液，混和均匀后，滴加浓硫酸6.0 mL，摇匀，水浴加热20 min后，冷却20 min，用蒸馏水定容至20 mL，备用。取溶液适量，在400～700 nm 范围内扫描，确定多糖类成分的最大吸收波长，另取蒸馏水同法平行操作为空白对照，实验表明，在490 nm处有最大吸收峰，说明在490 nm波长处，供试品溶液中其他成分对多糖的显色与吸收干扰最小，故选定490 nm为测定波长。

1.3.2 标准曲线建立

分别移取葡萄糖标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL于10 mL的容量瓶中，分别依次加入1.0 mL的蒸馏水，5%苯酚溶液2.0 mL，摇匀，迅速分别滴加浓硫酸6.0 mL，完成以上操作后放在90 ℃的水浴中加热30 min，冷却至室温，加蒸馏水定容，摇匀，静置15 min。用1 cm石英比色皿于490 mm处分别测定吸光度，另取蒸馏水同法平行操作空白对照，以吸光度A和葡萄糖标准品溶液的浓度C(mg/mL)作标准曲线。通过实验得到葡萄糖标准品溶液的标准曲线，见图1，建立的标准曲线回归方程为：A=18.675C+0.001 2，相关系数r=0.998 1。说明溶液在0～0.100 0mg/mL范围内具有良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

1.3.3 多糖的提取工艺流程

准确称取10 g唐古特青兰粉末，室温下，设定压力为300 psi，以水为萃取溶剂，用快速溶剂萃取仪萃取10 min后，在200 W下按照先萃取后超声的操作顺序，联合提取唐古特青兰多糖，抽滤除去残渣，以滤液与乙醇的体积比为1∶4加无水乙醇醇沉过夜，离心，取沉淀利用Sevage法除去蛋白，无水乙醇洗涤，真空干燥，得到多糖粉末。

1.3.4 多糖的测定

按1.3.3项进行多糖提取，在490 nm吸收波长下，按1.3.2项所述方法，测定溶液的吸收度(A)，计算多糖含量。

1.3.5 多糖提取单因素试验

以纯水为提取剂，考查液料比、提取温度、提取时间等因素对唐古特青兰中多糖提取率的影响。

1.3.6 唐古特青兰多糖提取的响应面试验

根据单因素试验结果，运用响应面法Box-benhnken试验设计原理，以提取时间、提取温度、液料比为因素，以多糖提取率为响应值，优化唐古特青兰中多糖的提取工艺，因素水平见表1。

表1 Box-behnken因素水平Tab.1 Box-behnken factor levels

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比

在温度为50 ℃、提取时间为80 min、超声波功率为200 W下，考察液料比对多糖提取率影响，见图2。

图2 液料比对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of Liquid- solid ratio on extraction rate of polysaccharide

由图2可见，随着液料比的增加，多糖提取率也随着增大，当液料比为7 mL/mg时，多糖提取率达到最高值，随后趋于平缓，表明多糖在溶液中溶解已达到饱和，综合考虑，在响应面试验设计中，以液料比7 mL/mg作为中心值。

2.1.2 提取温度

在液料比为7 mL/mg、提取时间80 min、超声波功率200 W条件下，考察温度对多糖提取的影响，见图3。

图3 温度对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

2.1.3 提取时间

以50 ℃为多糖提取温度、液料比为7 mL/mg、超声波功率为200 W的条件下，考察提取时间对多糖提取的影响，见图4。

图4 提取时间对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

由图4可知，多糖提取率随着提取时间的延长而增大，80 min后，时间对多糖提取率影响不显著，多糖在溶液中溶解达到饱和，因此，从节省能耗和操作时间考虑，在响应面试验设计中，选定80 min为提取时间的中心值。

2.2 响应面法优化多糖提取工艺

2.2.1 响应面试验

依据单因素试验结果，以多糖提取率作为响应值，选取多糖提取时间、提取温度、液料比等3个因素进行响应面分析法中Box-behnken试验设计，结果见表2和表3。

表2 Box-behnKen试验设计及结果Tab.2 Box-behnken experimental design and results

2.2.2 响应面分析法优化方程的建立及方差分析

夏国忠默默地放下电话，传令下去，把重伤员送往后方医院，轻伤就地包扎治疗。现在，那怕是多一个人在，就多一分胜利的希望。

通过Design-expert软件对表2数据进行二次回归拟合，拟合得到提取温度、提取时间、液料比3个影响因素与多糖提取率(Y)的二次多项式回归方程：

Y=65.50+4.78A+0.47B+2.98C-1.12AB-0.83AC+2.22BC-9.64A2-3.74B2-3.59C2

该回归多项式方程的总决定系数R2=0.983 7，表明该二次多项式回归方程可信度高，方程能较好地预测和分析多糖的提取率。

表3 二次多项式模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

由表3可知，通过方差分析，该二次多项式回归方程模型F值为28.77，P<0.000 1，表明该模型具有统计显著性。失拟项P=0.108 2>0.05，不显著，表明该模型可信度高，能较好地预测和分析多糖的提取率。

表4 二次多项式模型显著性分析Tab.4 Significance analysis of quadratic polynomial model

由表4可知，提取温度(A)、液料比(C)的P值均小于0.01，提取时间(B)的P值大于0.05，说明液料比和提取温度对多糖的提取率影响具有统计学意义(P<0.01)，提取时间不具有统计学意义(P>0.05)另外，交互项(AB、AC、BC)及二次项(A2、B2、C2)P<0.05，对多糖提取率的影响显著，3个因素影响顺序为：提取温度>液料比>提取时间。

表5 模型的可信度分析Tab.5 Reliability analysis of the model

表6 模型置信度分析Tab.6 Model confidence analysis

由表5和表6可知，二次多项式模型拟合实验数据效果好，可较好地预测和分析多糖的提取率。

由图5也可以看出，多糖提取率实验值与预测值存在良好的线性关系，回归方程能较准确预测唐古特青兰多糖的提取率。

图5 多糖提取率实验值与预测值关系图Fig.5 Comparison of experimental and predicted extraction rates of polysaccharides

2.2.3 因素交互作用分析

提取温度、液料比、提取时间3个因素存在显著的交互作用，结果见图7(a～b)。从图7(a～b)可知，3个因素两两之间交互作用的响应曲面坡度较陡峭，等高线密集，交互作用强。这与方差分析结果相符。

图6 两因素交互作用对多糖提取率影响的响应面及等高线Fig.6 Response surface and contour map of interaction of two factors on polysaccharide extraction rate

2.2.4 优化工艺参数的预测

采用响应面法，可得唐古特青兰中多糖最优提取工艺条件为：在溶剂萃取仪压力为300 psi、超声波功率为200 W下，液料比为7.71 mL/mg，提取温度为51.59 ℃，提取时间为80 min，该条件下多糖的理论预测提取率为67.36%。考虑实验室操作的可行性，修正提取工艺条件为：液料比为8 mL/mg，提取温度为52 ℃，提取时间为80 min。

2.2.5 优化工艺参数的验证实验

为了考察优化工艺的稳定性、可行性，在该工艺条件下，进行重复性试验3次，多糖的提取率结果见表7。由表7可知，多糖提取率的平均值为67.28%，与理论预测值67.36%的相对标准偏差为0.059 5%，说明该工艺稳定可行。

表7 验证实验结果Tab.7 Results of verification tests

3 结语

1)植物多糖是一类重要的生物活性物质，具有调节人体免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗缺氧、抗菌、抗病毒、保护肝脏等作用。基于现有的唐古特青兰多糖的提取方法具有一定的局限性，本研究采用的快速溶剂萃取-超声波辅助提取法，既能加速提取液渗透过程，有效破坏细胞壁，加快多糖溶解，提高多糖的提取率，同时还能降低提取溶剂水的用量，缩短提取时间，降低多糖提取成本。

2)采用响应面法对藏药唐古特青兰多糖的提取工艺进行优化，多糖最佳提取工艺条件为：在溶剂萃取仪压力为300 psi、超声波功率为200 W下，提取温度52 ℃、提取时间80 min、液料比为8 mL/mg。在此工艺条件下，多糖提取率的实际测量平均值为67.28%，与理论预测值67.36%基本吻合。

3)本研究是以水为溶剂，在快速溶剂萃取-超声波辅助下，进行唐古特青兰中多糖的提取。由于多糖是一类重要的生物活性物质，因此，该研究可为藏药资源的开发和利用提供参考。