老年系统性硬化症继发肺间质纤维化患者体内巨噬细胞因子、TGF-β1/Smad信号通路的应答及预测价值

杨晓静 冯冬梅 周向昭 陈雷刚 温杰 吴远慧 韩旭颖

(河北北方学院附属第一医院皮肤科，河北 张家口 075000)

系统性硬化症(SSc)是一种系统性自身免疫性疾病，其特征是内皮功能障碍导致小血管病变，成纤维细胞功能障碍导致胶原蛋白过度生成和纤维化及免疫异常〔1〕。SSc根据皮肤受累程度分为弥漫性皮肤硬化症(dcSSc)、局限性皮肤硬化症(lcSSc)或SSc正弦硬皮病。尽管实际上任何器官系统都可能参与疾病过程，但SSc的纤维化和血管性肺部病变〔包括间质性肺疾病(ILD)和肺动脉高压(PH)〕是主要的死亡原因；而且老年患者更容易出现这种严重的并发症。40% SSc-ILD患者被确诊后生存期无法超过10年〔2〕。目前，对于其发病机制已经有了一定了解，持续炎症反应、抗氧化体系及氧化体系失调、促炎因子与促纤维化因子大量积蓄均为其出现的主要原因。随着针对这些肺部疾病新疗法的出现，肺部受累的早期识别对于这些患者的护理至关重要。巨噬细胞中的细胞因子在老年SSc继发肺间质纤维化患者体能有不同的表达水平。本文针对SSc患者直接和间接肺部表现，并检测各类人群体内巨噬细胞各项因子的表达，分析其水平与SSc继发肺间质纤维化之间的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年5月至2019年5月河北北方学院附属第一医院收治的SSc肺间质纤维化患者30例、非特异性肺间质纤维化患者30例及在此期间来医院门诊进行体检的健康人群30例，分别为特异组、非特异组和健康组。 纳入标准：①年龄>60岁且<72岁；②非特异组符合SSc诊断标准；③特异组符合SSc-ILD诊断标准。 排除具有免疫系统严重缺陷者。3组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组一般资料对比

1.2检测方法 血清检测：双抗体夹心ELISA法检测转化生长因子(TGF)-β，入院后晨7时空腹抽取静脉血，室温下静置3～4 h，3 000 r/min离心10 min后取血清，置-20℃冰箱保存待测；肺泡检测：于采血同天进行支气管肺泡灌洗(BAL)检测白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α水平，BAL术：OlympusBF10型纤支镜远端术契于舌叶或中叶管口，注入37%生理盐水200 ml，分4次，每次50 ml，注入后在25～100 mmHg负压下立即吸引，回收液用单层纱布过滤后2 000 r/min离心10 min，在细胞计数盘下计数细胞总数，并用W-G染色制片进行细胞分类。上清液置-20℃下保存待测。采用双抗体夹心ELISA，试剂盒为美国Sigma公司产品，按操作说明进行。

1.3统计学方法 使用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.13组IL-8、TNF-α、MIP-1α水平比较 健康组IL-8、TNF-α、MIP-1α水平明显低于非特异组与特异组，且非特异组明显低于特异组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组IL-8、TNF-α、MIP-1α水平比较

2.23组血清TGF-β水平比较 健康组血清TGF-β水平〔(0.42±0.12)μg/L〕明显低于非特异组〔(0.82±0.26)μg/L〕与特异组〔(1.36±0.38)μg/L〕，且非特异组明显低于特异组(P<0.05)。

3 讨 论

进行性SSc或硬皮病是一种系统性炎症性疾病，其特征在于皮肤和内部器官的血管损伤、炎症和纤维化〔3〕。SSc在1752年由意大利的Carloarlozio博士首次描述为“使皮肤变成木头”的疾病〔4〕。从此其患病率和发病率持续上升，除了累及皮肤和关节外，还可以影响包括肺、肾和胃肠系统在内的多个器官〔5〕。虽该病多发于育龄期女性，但患有该病的老年患者更容易累计全身器官，出现严重并发症。PH和ILD是硬皮病患者发生率最高的肺部并发症，其中1/3的患者患有肺间质纤维化。40%进行性SSc和ILD患者在被确诊后生存期无法超过10年〔6〕，在这种情况下，ILD或PH占死亡率的60%〔7〕。自1980年代以来，硬皮病肾病的成功治疗已使肺部并发症(例如PH)成为这些患者最常见的死亡原因，13% SSc患者中存在严重的限制性肺疾病。高分辨率CT(HRCT)是无创诊断SSc-ILD的标准方法，可以检测到轻度异常。HRCT异常的真实发病率难以确定。尽管HRCT在SSc-ILD中很敏感，但仍有局限性，许多胸部检查异常的患者在复查时会出现HRCT扫描异常。尽管存在这些局限性，但基线时正常HRCT的存在仍代表SSc-ILD的发病率较低。

在SSc患者中观察到的HRCT模式通常是非特异性间质性肺炎(NSIP)、毛玻璃样混浊(GGOs)的比例更大，粗网状度较低，HRCT显示，基底占主导地位的网状结构和GGO，且没有明显的蜂窝状样征，与NSIP一致。患者的食道中也有空气流通，这与硬皮病相关的食道功能障碍一致。也可以看到通常的间质性肺炎(UIP)模式，HRCT显示周围和基底占主要的网状结构和蜂窝状结构，且没有明显的GGO，其模式与通常的UIP一致。该患者还患有与硬皮病相关的食道功能障碍相一致的充气食道。蜂窝囊肿在多达1/3的SSc-ILD患者中可见，在lcSSc患者中更常见。HRCT上看到的模式预示了潜在的组织病理学，网状组织代表了活检组织中的潜在纤维化，巩固代表了炎症。HRCT变化的可逆性很少见。相反，随着时间的推移，放射学进展似乎是用蜂窝/牵拉性支气管扩张和(或)支气管扩张代替GGO(肺内磨玻璃密度影)的一种。无论采用何种疗法，多达2/3的GGO患者会进展为纤维化。

TGF-β为多效细胞因子，由纤维细胞、炎性细胞及受损肺细胞产生，其中TGF-β1对肺间质纤维化的发病具有重要价值。TGF-β不仅为生成血管、修复损伤和调节免疫所必需，又是肺间质纤维化和恶性肿瘤的关键因素〔8〕。其可以促进上皮细胞迁移、凋亡及上皮间质转化。同时，TGF-β通过纤维细胞和上皮细胞诱导内皮生长因子在内的多种关键血管生成因子分泌，促进血管生成环境，但随时间的推进，胶原蛋白过多积累会抑制血管形成。免疫应答调节中TGF-β也具有关键性作用，受损组织释放出TGF-β，将炎性细胞聚集到损伤处，这会进一步释放 TGF-β而加剧纤维化〔9〕。有研究发现，早、晚期SSc-ILD 的肺组织基因表达和BAL中活化标志物、巨噬细胞迁移表达异常及TGF-β、干扰素-α表达上调，说明SSc-ILD 中肺间质纤维化进展与巨噬细胞的聚集活化与 TGF-β 基因上调有密切关系〔10〕。

Smad信号通路是TGF-β信号传导的主要途径，通过诱导细胞进行侵袭、分化、迁移或广泛增长参与肺纤维化发展。有研究指出，TGF-β1/Smad2/3信号传导会激活间充质细胞和上皮细胞在Wnt/β-连环蛋白通路的活化〔11〕。TGF-β与异二聚体结合，产生经典途径及非经典途径。经典途径：Smad2/3的磷酸化被TGF-β所引起，前者会与Smad4融合，最终在核膜处出现新的复合物，Smad4会充当此过程中的转录激活因子，引起大量ECM表达。非经典途径：通过特异调节蛋白介导信号的MAPK、PAR6、RhoA等传导，TGF-β1会激活Smad2/3，蛋白激酶/JUNN末端激酶信号通路也被应激激活，α-SAM的表达被提高〔12〕。成纤维细胞转化为肌成纤维细胞和刺激肌成纤维细胞增殖可能通过激活TGF-β/Smad2/3信号通路的间充质转换。

SSc-ILD的发病机制尚不清楚。据推测，这与内皮细胞、淋巴细胞/单核细胞和成纤维细胞之间的异常相互作用有关，导致在组织缺氧和血管高反应性的情况下成纤维细胞过量产生细胞外基质。患者BAL液中促炎细胞因子IL-8、TNF-α和MIP-1α水平升高〔13〕。由于SSc-ILD患者的抗拓扑异构酶抗体水平和抗成纤维细胞抗体较高，B细胞也可能参与其中，后者已被证明可以激活成纤维细胞并诱导细胞外基质的产生。

MIP-2有强大的聚集单核/巨噬细胞及T细胞的作用，在炎症反应中能够趋化白细胞到病变部位聚集〔14〕。

IL-8是一种活化因子和中性粒细胞趋化，产生并分泌于多种炎性细胞，常人下呼吸道和肺部炎症免疫调节出现异常时，较多的中性粒细胞浸润下呼吸道，从而不断产生IL-8，而IL-8引导毛细血管中的中性粒细胞转移到肺部，以此恶性循环，中性粒细胞会产生多种活性物质，损伤细胞外基制，肺泡结构也就遭到了破坏〔15〕。如肺泡炎症反应无法得到有效的控制，则最终会导致肺间质纤维化的出现〔16〕。

TNF-α对于炎症反应具有多效性，会促进肺泡Ⅱ细胞凋亡，肺组织自我修复也会受到抑制。其还可以招募聚集性粒细胞，会促进炎症反应增大〔17〕。且在肺间质纤维化发病机制中起重要作用〔18〕。

综上，巨噬细胞中的TGF-β、TNF-α、IL-8、MIP-1α对老年SSc继发肺间质纤维化患者具有重要表达意义，早期对此类指标进行检测并加以干预可以有效降低SSc-ILD的发病率，为SSc患者的早期预防及SSc-ILD患者的临床治疗具有重要参考价值。