超高效液相色谱-串联质谱在维生素检验中的应用

摘要：维生素分为脂溶性维生素和水溶性维生素。目前，其检验方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、化学免疫发光法和超高效液相色谱-串联质谱法等。其中，免疫检验法无法区分其亚型及同分异构体，因此经常会出现假阳性或假阴性。超高效液相色谱-串联质谱法以检验速度快，分辨率高，灵敏度高，特异性高等优点成为标本内小分子檢验分析的金标准，快速应用于临床实验室诊断的多个方向。为减少标本采集量及一次进样同时检验多种维生素提供了检验平台。

关键词：检验原理;在维生素检验中的应用;局限性

一、超高效液相色谱-串联质谱法检验原理

经预处理的标本进入超高效液相色谱（UPLC）系统，经色谱柱分离、纯化和浓缩，被导入质谱仪的离子源。标本在离子源内电离，带电离子在接口内进行去溶剂，通过Q0聚集、冷却进入三重四级杆质量分析器，根据离子的质荷比（m/z）进行分离。Q1质量分析器被设定为选择特定的母离子，母离子在Q2碰撞室碎化、裂解，产生的子离子进入Q3质量分析器进行分离。检验器记录离子的信号，然后将信号传输到电脑绘制成图谱。以稳定同位素内标来校准和消除测量误差，将标本与相应内标峰面积比代入标准曲线方程计算血清标本中对应维生素含量。具体如下：

二、在维生素检验中的应用

维生素分为脂溶性维生素和水溶性维生素。其中，脂溶性维生素包括维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K;水溶性维生素包括维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12以及维生素C。维生素是人体所必需的微量营养成分，是机体酶系统中辅酶的重要组成部分，对新陈代谢起调节作用。一般在体内不能合成或合成量很少，需通过饮食等手段获得。维生素缺乏或过量均会导致营养性疾病的发生，故提高维生素检验准确性、特异性是满足临床检验诊断需求的必然。

不同维生素具有不同的分子式，化学性质也不尽相同，即使相同维生素，也有不同的分子结构。维生素检验从标本预处理到准确检验应用方法都存在着不同的技术挑战。例如酶联免疫分析法、化学免疫发光法无法区分维生素亚型及同分异构体，易与自身内抗体发生交叉反应，特异性较低，因此经常会出现假阳性或假阴性。而且不同检验品牌试剂对不同目标免疫化合物的免疫捕获率也会存在一定差异，不同检验平台的免疫检验方法结果可比性较差。

超高效液相色谱-串联质谱法以检验速度快，分辨率高，灵敏度高，特异性高等优点成为标本内小分子检验分析的金标准，快速应用于临床实验室诊断的多个方向，逐渐被临床检验医学专家们所广泛关注。在欧美国家，超高效液相色谱-串联质谱法作为检验医学行业协会公认的生物标本内小分子分析的金标准方法，已被其权威检验机构广泛应用于临床研究及诊断。

以维生素D检验为例，人体维生素D主要来源于经阳光和皮肤作用合成的维生素D3，另一种来源是食物中的维生素D2，两者均需要在肝脏中单羟基化为25-羟基维生素D3（25-OHD3）和25-羟基维生素D2（25-OHD2），然后再经过肾脏两次羟基化才能转变为具有生物活性的微量双羟基代谢产物1，25-（OH）2D，其中25-OHD2和25-OHD3是人体血清中25-羟基维生素D（25-OHD）主要的存在形式。同时人体中还存在25-OHD3的异构体，但目前传统的免疫检验方法无法区分亚型维生素D2、D3及异构体。因此，超高效液相色谱-串联质谱法对于医生干预补充维生素D2的人群，婴幼儿及肾功能异常的患者具有重要意义，还可用于评价免疫法的交叉反应程度。此外，由于维生素具有不同的化学结构，免疫方法学需要不同的抗体及方法，而超高效液相色谱-串联质谱法是分子水平的检验，可以一次进样同时检验多种维生素及其相关活性代谢产物。

一次标本处理且检验多种维生素的难点在于各待测物在人体血清中的含量差别较大，如人体血清中维生素A、E的含量较高而维生素K的含量微乎其微，且各维生素的极性差别较大，传统检验方法很难同时满足对维生素在线性范围内进行检验并满足其高灵敏度的要求。此外，不同人体血清中的内源性物质对维生素检验还存在严重的基质效应。先进的超高效液相色谱-串联质谱法可以实现同时检验多种维生素的需求，其优势在于：预处理方法采用96孔板方法，简化了实验步骤、大大缩短了预处理时间，提高了检验通量;采用梯度洗脱，在缩短分析时间的同时获得了较好的去介质及分离效果，一次进样可同时得到多种维生素检验结果。同时在预处理过程中添加内标以消除不同基质标本中内源性物质对待检物的影响，进而提高检验结果的准确性。

三、局限性

专业人才培养是临床实验室迎接超高效液相色谱-串联质谱检验时代来临的基础。不同于临床常规检测.超高效液相色谱-串联质谱技术专业人才需经过长期培训、临床实践和经验积累，临床实验室应在引入超高效液相色谱-串联质谱技术前充分重视专业人员的培养工作。目前，国内临床实验室缺乏大量有经验的超高效液相色谱-串联质谱技术专业人才，这严重制约了质谱技术快速转化至临床实践。

我国临床实验室对质谱检验新项目建立和方法性能评价的经验相对不足，大多参照国外文献和少部分国内经验进行方法学建立、性能评价、设立评估标准和质量管理。这种自我管理模式为内部质量管理和外部标准化带来巨大挑战，因此亟待我国相关部门出台针对质谱相关的临床实践指南以规范质谱临床检测。

国内不同临床实验室间技术水平与能力参差不齐，人员素质和检验系统存在一定差异，若放松对质谱技术临床应用的监督和管理，任其恣意发展，最终带来的只能是“乱象”，而直接参照美国FDA的监管，则将可能极大阻碍我国质谱技术在临床实验室领域的发展。对于我国临床实验室现状而言，质谱技术临床应用的发展需求远远重于监管需求。如何满足日益增长的临床需求，鼓励质谱技术在临床实验室中得到科学普及和规范应用则是我们需要考虑的问题。

参考文献：

[1]袁小芬，马金飞，杨青青，液相色谱-串联质谱技术在维生素检测中的应用[J].中华检验医学杂志，2019，42（6）。

[2]中华医学会检验医学分会，卫生计生委临床检验中心.液相色谱-质谱临床应用建议[J].中华检验医学杂志，2017，（10）.

[3]禹松林，方慧玲，张瑞苹，等.改良超高效液相色谱串联质谱法测定25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3[J].检验医学，2015，（10）.

作者简介：

尚丽丽，女，汉族，医学学士（医学检验专业），13年临床实验室工作经验，主要从事生殖遗传，优生优育，亚健康评估等方向的检验研究工作。