新型瘦肉精班布特罗胶体金快速检测卡的制备

李鹏 郭燕 矫胜田

摘要：应用胶体金免疫层析技术，通过对标记抗体的pH值、抗体浓度和重悬液的条件优化进行斑布特罗胶体金快速检测卡的研制。结果表明，其灵敏度达到0.1 ppb。该检测卡简单、快速、灵敏度、特异性、稳定性、重复性好，与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等常见的瘦肉精均无交叉反應。检测70份猪组织样品与ELISA结果符合率为91%。结果表明，研制的班布特罗胶体金快速检测卡可应用于基层养殖、屠宰、市场环节动物及动物产品的现场快速检测。

关键词：胶体金技术;班布特罗;pH值;抗体浓度;重悬液

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.052

Abstract： The development of the Bambuterlol colloidal gold rapid detection card was optimized by the colloidal gold immunochromatography technique by optimizing the pH，antibody concentration and resuspension conditions of the labeled antibody. The results showed that the sensitivity reached 0.1 ppb. The test card was simple，rapid，sensitive，specific，stable，and reproducible，and has no cross-reaction with common clenbuterol such as clenbuterol，salbutamol and ractopamine. The coincidence rate of 70 pig tissue samples with ELISA results was 91%. The results showed that the developed bambuterol colloidal gold rapid test card could be applied to the on-site rapid detection of grassroots aquaculture，slaughtering，market segment animals and animal products.

Key words：colloidal gold technology;bambuterol;pH;antibody cocentration;resuspension

0   引言

班布特罗（Bambuterol）是由Astra公司开发，1987年上市，是继莱克多巴胺、克伦特罗和沙丁胺醇之后的新一代β -肾上腺素受体类激动剂。最初被用于治疗阻塞性呼吸道疾病，如支气管性哮喘、慢性支气管炎和肺气肿[1]。20世纪80年代有研究表明，β -肾上腺素受体类激动剂能影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，使动物体内脂肪代谢增强，蛋白质合成增加，可以明显减少胴体的脂肪含量，提高胴体瘦肉率和饲料利用率[2-3]，达到促进家畜生长、改善肉质的效果，但是如果人体过多摄入班布特罗等β -肾上腺素受体类激动剂可导致急慢性中毒、心率失常等疾病，长期摄入甚至可致染色体畸变，引发恶性疾病[4-5]。因此，被禁止作为饲料添加剂用于动物源性食品生产中，但仍有不法商家为谋求利益铤而走险。

目前检测瘦肉精的检测方法众多，主要包括色谱技术[6]和免疫分析技术[7-8]。高效液相色谱法灵敏度高、选择性好，但技术要求高、仪器昂贵，且不适合现场快速测定。胶体金免疫层析技术可快速、准确检测出食品中有害有毒物质残留，操作简单、便于现场操作，已广泛应用于食品安全检测领域。研究对新型瘦肉精班布特罗胶体金检测的工艺流程进行优化，探索胶体金检测卡制备的最适条件，提高班布特罗快速检测卡质量，并实现快速、准确现场检测班布特罗，同时也为基于胶体金技术的其他检测产品的研究与探索提供参考。

1   材料与方法

1.1   材料和仪器

1.1.1   材料

氯金酸，国药集团提供;班布特罗单抗，自行研制;班布特罗抗原，上海金标提供;班布特罗标准品，北京中科质检生物提供;胶体金耗材套装，上海杰一生物提供;羊肉、牛、猪肌肉组织样品、尿样，采自当地屠宰场。

1.1.2   试验仪器

XYZ HM3030型喷金划膜仪、WM-100型切条机，上海金标产品;SIGMA型台式高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计，上海光谱仪器产品。

1.2   试验方法

1.2.1   金标垫的制备

用质量分数1.35%的红色金颗粒标记取1 mL胶体金溶液于2 mL试管中，加入浓度为0.2 mol/L的K2CO3添加2.0 μL/mL，混匀;加入抗体原液1.0 μL，混匀后静置5 min;加入封闭液10 μL/mL（10%BSA），混匀后静置5 min;在4 ℃下以转速12 000 r/min离心      5 min;1/20体积的复溶液复溶，喷涂于已封闭好的玻璃纤维素膜上，迅速转移至冷冻干燥机内进行冷冻干燥，制成金标垫。

1.2.2   样品垫和吸水垫的制备

样品垫为玻璃纤维素膜浸没入封闭液（质量分数2%～3%牛血清白蛋白的浓度为0.01 mol/L磷酸缓冲液）进行封闭，于37 ℃下干燥备用。吸水垫为吸水性能较好的吸水滤纸材料。

1.2.3   硝酸纤维素膜（NC膜）的包被

用包被液将制备的人工班布特罗抗体稀释50倍为作为T液，PC-2羊抗鼠单克隆抗体稀释250倍作为C液。将制备的C液、T液分别在NC膜上划线，从左至右顺序依次为T液和C液，置于37 ℃下干燥20～40 min，干燥后浸没至封闭液中封闭，置于37 ℃恒温箱中干燥备用。

1.2.4   检测卡的组装

将制备好的样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫裁剪为宽度相同的长方形，把人工抗原用包被液50倍稀释后用移液器点1 μL于空白NC膜上，背板一端贴上吸水纸，另一端贴上处理后的金标垫与样品垫，辅料之间相互连接，两端均压NC膜1～2 mm，切成宽3.5 mm的条子，组装成检测班布特罗含量的检测卡。

2   结果与分析

2.1   胶体金快速检测卡pH值的优化

用质量分数1.35%的红色金颗粒标记，浓度为  0.2 mol/L的K2CO3分别添加1.5，2.0，2.5，3.0 μL/mL，抗体标记量为5 μL/mL，每个条件标记1 mL，10%BSA封闭，复溶液复溶至100 μL，备用。

胶体金快速检测卡pH值见图1。

由图1可知，添加1.5 μL/mL K2CO3时效价最好。

2.2   抗体标记量的优化

在上述标记条件下，抗体标记量调整为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL/mL。

抗体标记量显色图见图2。

由图2可知，抗体标记量在1.5 μL/mL时显色最好。

2.3   班布特罗胶体金快速检测卡灵敏度测试

通过使用研制的班布特罗胶体金快速检测卡对含有班布特罗的样品进行检测。

班布特罗胶体金快速检测卡灵敏度见图3。

由图3可知，获得的班布特罗胶体金快速检测卡灵敏度达到0.1 ppb，通过调试产品达到检测需求。

2.4   班布特罗瘦肉精检测卡性能验证

2.4.1   灵敏度和重复性检测

班布特罗检测卡灵敏度检测的T、C 线显色结果见表1，试纸条重复性的检测见表2。

由表1可知，当班布特罗标准液质量浓度达到0.1 ng/mL时T线不显色，为阳性;随着标准品质量浓度的增加T线不显色，C线颜色增深，表明班布特罗瘦肉精检测卡的最低检测限为0.1 ng/mL。班布特罗试纸条加入阴性PBS后，T、C 显色清晰。由 表2可知，检测卡的批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0%。

2.4.2   特异性检测

为了验证研发的班布特罗检测卡的特异性，通过滴加不同质量浓度的常见的3种瘦肉精盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，结果表明试纸条与上述3种瘦肉精均未有交叉反应出现，表现出良好的特异性。

试纸条的特异性检测见表3。

2.5   班布特罗检测卡检测应用

分别使用班布特罗检测卡和ELISA试剂盒对70份猪组织样品进行检测，结果ELISA检测出33份阳性，班布特罗检测卡检测出30份阳性，二者的符合率为91%。

3   结论

养殖环节非法添加瘦肉精已经是普遍现象，目前新型瘦肉精的不断出现给监管部门执法监管带来很大障碍，尤其是缺乏现场快速检测技术。胶体金免疫层析技术近年来发展迅速，因其操作简便、快捷、特异性强、灵敏度高且便于现场操作，已广泛应用于食品安全检测领域。研究制备的新型瘦肉精班布特罗胶体金检测卡的灵敏度为0.1 ng/mL，且特异性好，与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等常见的瘦肉精均无交叉反应。而且使用方便、快速准确、成本低，可用于班布特罗的快速检测，适合基层兽医站、养殖企业、屠宰企业、市场监管部门等使用。

参考文献：

Svensson L A. Terbutaline prodrugs and oral β2-agonist therapy[J]. Pharmacol Toxicol，1995（3）：30-33.

Baker P K，Kiernan J A. Phenylethanolamine derivatives and acid addition salts thereof for enhancing the growth rate of meat-producing animals and improvingthe efficiency of feed utilization thereby[P]. United States Patent 4404222，1983-09-13.

Baker P K，Dalrymple R H，Ingle D L，et al. Use of a β-adrenergic agonist to alter muscle and fat deposition in lambs[J]. Journal of Animal Science，1984，59（5）：1 256-    1 261.

杨永倩，王俊杰，张勃伟.“瘦肉精”的危害、肉眼判断及其快速筛查技术[J]. 陜西农业科学，2016，62（10）：87-89.

曲艺. 猪肉中瘦肉精残留的危害及检测方法[J]. 现代畜牧科技，2016（7）：178-182.

丁芳林，张朝辉，谭胜国，等. 高效液相色谱法测定猪肉中的盐酸克伦特罗的研究[J]. 食品与机械，2007，23（5）：117-118.

史建国，邵秀芝，韩庆慧. 竞争酶联免疫吸附法测定猪肉中的瘦肉精[J]. 粮油食品科技，2005，13（3）：47-48.

吴巧丽，叶春生. 胶体金免疫层析技术快速检测沙丁胺醇残留[J]. 现代食品科技，2012（11）：1 595-1 599. ◇