大蒜抗根结线虫内生细菌的筛选及盆栽防效试验

黄开伟　李敏敏　史倩倩

摘要：利用稀释涂布平板法，从受根结线虫为害的大蒜根须组织研磨液中筛选对根结线虫有明显抑杀效果的内生生防细菌。结果表明，在盆栽试验中，菌株S1-1对根结线法的杀线虫由活性为90.8%。通过盆栽试验验证生防菌株的防效，菌株S1-1防效为74.86%。结合菌株形态特征、分子生物学和生理生化特性，将菌株S1-1鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

关键词：根结线虫;生防细菌;筛选;芽孢杆菌;试验

中图分类号：S436      文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.038

Abstract：The screening and identification of biocontrol bacteria from garlic root against root-knot nematode was performed using dilution methode. The results showed that the nematicidal activity of strain S1-1 against Meloidogyne incognita was 90.8%，and biocontrol effect of strain S1-1 was up to 74.86% against Meloidogyne incognita in pot experiment. Combined its morphlogicul characteristics，morphological characteristics and biochemical characteristics，Strain S1-1 was identified as Bacillus pumilus.

Key words：root-knot nematode;biocontrol bacteria;screening;Bacillus spp.;experiment

根结线虫病是如今设施农业中重要的土传病害之一，每年在全球范围内造成的损失高达1 000亿美元[1-3]。根结线虫寄主范围十分广泛，大部分农作物都可以成功侵染，严重时作物减产高达75%以上。利用稀释涂布平板法从受根结线虫为害的大蒜根须组织研磨液中进行根结线虫生防细菌的筛选，并得到一株对根结线虫具有较好防治效果的芽孢杆菌菌株，为根结线虫的生物防治提供了资源。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   植物样品

山东青岛采集的受根结线虫为害的大蒜样品。

1.1.2   供试线虫

南方根结线虫，青岛农业大学植物医学学院线虫实验室提供。

1.1.3   LB固体培养基（LBA）培养基配方

胰蛋白胨5 g，酵母抽提物2.5 g，NaCl 5 g，琼脂粉7.5 g，蒸馏水定容至500 mL，pH值7.0。

1.2   试验方法

1.2.1   生防细菌的分离

称取受根结线虫为害的大蒜根须10 g，用1%的次氯酸钠消毒5 min，再用无菌水漂洗3遍，放入灭菌研钵中研磨成糊状，然后用少量无菌水洗入装有90 mL无菌水的三角瓶中;充分混匀后静置10 min;吸取100 μL稀释液均匀涂布在LBA培养基于37 ℃恒温培养2～3 d;挑取形态不一样的单菌落用平板划线法分离纯化，将得到的菌株转接到LBA培养基斜面培养24 h，于4 ℃下进行保存。

1.2.2   南方根结线虫悬浮液制备

从南方根结线虫的空心菜上挑取成熟的线虫卵块，用0.5%的次氯酸钠消毒1 min，无菌水冲洗干净。将卵块收集到灭菌培养皿中，加入少量无菌水，于28 ℃下恒温孵化，48 h后收集孵化的线虫，备用。

1.2.3   生防细菌的筛选

挑取4 ℃保存于LBA培养基斜面的菌株，于LBA平板上划线、活化，1 d后挑取单菌落转接到装有100 mL的LB液体培养基的三角瓶中，于37 ℃，200 r/min培养48 h。发酵结束后，取发酵液以转速  9 000 r/min離心10 min，取上清液备用。取24孔板向其中加入1 mL上清液，对照组加等量无菌水，挑入大约50条线虫，于28 ℃下恒温培养，记录24 h后线虫死亡数，计算线虫的校正死亡率。筛选出对南方根结线虫触杀效果强的生防菌株。

1.2.4   生防菌形态观察

将对根结线虫直接触杀效果良好的细菌在LBA培养基平板上划线，于37 ℃下恒温培养24 h，观察细菌的单菌落形态，再对菌株进行革兰氏染色、镜检。

1.2.5   生理生化鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》8与《常见细菌系统鉴定手册》9对筛选出来的根结线虫触杀效果良好的生防细菌进行伏-普试验、柠檬酸盐利用试验等生理生化鉴定。

1.2.6   细菌DNA的提取及16 SrDNA基因序列分析

利用OmegaBio-Tek试剂盒提取生防芽孢杆菌的DNA;采用16 SrDNA细菌通用引物27F/1492R进 行PCR扩增;PCR反应体系（25 μL）：10X Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物27F/1492R各1 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 16 μL，模板DNA 2 μL;反应参数：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s。63 ℃退火30 s;72 ℃延伸90 s;共35个循环;72 ℃总延伸7 min;4 ℃保存。PCR扩增后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，经过NCBI数据库进行BLAST比对分析，构建系统进化树。

1.2.7   根結线虫生防细菌盆栽防效试验

待供试番茄（丽春）长出第4片真叶后，进行细菌发酵液的制备，菌体浓度最终调成1×107/mL。在处理组番茄根部浇20 mL生防菌发酵液，对照番茄根部仅浇灌无菌水。3 d后，在番茄根部均匀接种南方根结线虫二龄幼虫（1 000条/株），每个处理20棵番茄，接种37 d后调查番茄发病情况，参考Bridge和Page的方法对根结分级[4]，统计番茄的根结数和病情指数计算出防效。

根结线虫的根结分级判定见表1。

2   结果与分析

2.1   拮抗线虫生防细菌筛选结果

通过稀释涂布平板法初步分离出102株细菌，再通过南方根结线虫直接触杀试验进行复筛得到4株对南方根结线虫生防效果较好的细菌。其中，S1-1菌株于37 ℃，200 r/min培养48 h后其发酵液对南方根结线虫的致死率达到90.08%。

生防菌发酵液对南方根结线虫的触杀防效见  表2。

2.2   菌株S1-1的形态特征

S1-1在LB培养基上菌落颜色为污白色，菌落形状呈杂草状散生，在10%的NaCl培养基上菌落形态为圆形、边缘较整齐、表面光滑、菌落不隆起、不透明、培养基颜色未见明显变化。经革兰氏染色后，菌株形态为杆状，呈紫红色，因此S1-1是革兰氏阳性菌。

2.3   菌株S1-1的生理生化特征

芽孢杆菌DR2-1和S1-1的生理生化特性见表3。

2.4   菌株S1-1基因序列分析结果

对菌株S1-1的16S rDNA基因序列用Blast进行序列比对分析，并构建系统发育树。通过系统发育树发现，菌株S1-1与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）属同一个分支，结合菌株形态特征和生理生化鉴定结果，可以鉴定菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

2.5   菌株S1-1对南方根结线虫的防效测定

通过盆栽试验进一步测定菌株S1-1对南方根结线虫的防治效果。结果表明，施用菌株S1-1的发酵液后，处理组番茄根结数目及病情指数明显低于对照组，防治效果达到74.86%，表明菌株S1-1对南方根结线虫具有良好的防治作用。

南方根结线虫盆栽试验见表4。

3   结论

从受根结线虫为害的大蒜根须中共分离出4株对南方根结线虫直接触杀效果较好的生防细菌。盆栽防效试验结果表明，菌株S1-1对南方根结线虫具有良好防效。结合菌株形态特征和生理生化鉴定结果，鉴定该菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

参考文献：

赵鸿，彭德良，朱建兰. 根结线虫的研究现状[J]. 植物保护，2003（6）：6-9.

刘维志. 植物线虫志[M]. 北京：中国农业出版社，2003：124-130.

李晓平. 剧高毒杀线剂相继被禁限用将为环保低毒新杀线剂腾挪市场空间[J]. 农药市场信息，2018（27）：30-33.

Bridge J，Page S L. Estimation of root-knot nematode infestation levels on roots using a rating chart[J]. Tropical Pest Management，1980（26）：296-298. ◇