HPLC法检测几种α-酮酸化合物的柱前衍生化条件优化

杨阳 焦淑玲 朱美旗

摘      要：目的 为了筛选柱前衍生-HPLC法测定-酮酸化合物的最优衍生化条件。方法 采用紫外分光光度法检测-酮酸标准品衍生化后的最大吸收波长。运用单因素试验，以柱前衍生-HPLC法所检测出的峰面积作为评价指标，对影响衍生化反应的因素（pH值、温度、加热时间、物质的量的比例）进行优化。结果 丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐与衍生化试剂4-硝基-1，2-苯二胺（NPDA）反应所得的衍生化产物产生的紫外吸收最大波长约为260 nm。丁酮酸最佳衍生条件是pH=3、60 ℃、加热2 h、衍生化试剂与其物质的量比为10∶1;丙酮酸钠最佳衍生条件是pH=3、80 ℃、加热1 h、衍生化试剂与其物质的量比为10∶1;酮戊二酸单钾盐最佳衍生条件是pH=5、80 ℃、加热1 h、衍生化试剂与其物质的量比为8∶1。同时对该方法的线性范围和精密度进行了考察。结论 本研究说明NPDA作为衍生化试剂与-酮酸类化合物反应后，能够提高 -酮酸类化合物的檢测灵敏度和准确性，为检测生物样品、药品、化妆品等中的-酮酸类化合物提供参考。

关  键  词：-酮酸;NPDA;柱前衍生-HPLC法

中图分类号：O658        文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）08-1820-05

Abstract： Objective In order to screen the optimal derivatization conditions for determination of α-keto acid compounds by pre-column derivatization-HPLC method.Methods The maximum absorption wavelength was determined by UV-spectrophotometry. Using single factor test， the peak area detected by HPLC-precolumn derivatization method was used as the evaluation index to optimize the influence factors of derivatization reaction（pH value， temperature， heating time and the proportion of the amount of substance）.Results The derivatized product obtained from the reaction of butyric acid， sodium pyruvate， ketoglutarate monopotassium salt with the derivatization reagent 4-nitro-1，2-phenylenediamine （NPDA） produced the maximum UV absorption wavelength of approximately 260 nm. The optimal derivatization conditions for butyric acid were as follows： pH=3， the temperature 60 ℃， the heating time 2 h， the molar ratio of derivatization reagent to its substance 10∶1; the optimal derivatization conditions for sodium pyruvate were as follows： pH=3， the temperature 80 ℃， the heating time 1 h， the molar ratio of derivatization reagent to the substance 10∶1; the optimal derivatization conditions of ketoglutarate monopotassium salt were as follows： pH=5， the temperature 80 ℃， the heating time 1 h， and the molar ratio of derivatization reagent to its substance 8∶1. At the same time， the linear range and precision of the method were investigated.Conclusion This study shows that NPDA， as a derivatization reagent， can improve the detection sensitivity and accuracy of α-keto acid compounds after reacting with α-keto acid compounds， and the paper can provide some reference for the detection of α-keto acid compounds in biological samples and drugs， cosmetics.

Key words： α-Keto acid; NPDA; Precolumn derivation-HPLC method

α-酮酸（Alpha-keto acid）是一种具有双官能团的生物活性物质，可作为有机合成和生物合成的中间体，在医药、化妆品、食品等领域有重要的应用价值[1]。例如α-酮酸与低蛋白饮食搭配改善慢性肾炎患者的症状[2]，可以减少内源性尿素、有毒离子和代谢产物生成，还可以改善患者的营养状况[3];  α-酮酸加入食品中，可以改善口感，还能促进脂肪的消耗[4];在化妆品中，α-酮酸具有保湿、防皱、抗衰老、抗过敏等功能[4]。

组织中α-酮酸的物质的量浓度可用于诊断氨基酸代谢先天缺陷疾病，如枫糖浆尿症（MSUD）、苯丙酮尿症（PKU）、高蛋氨酸血症、酪氨酸血症[5]。丙酮酸的水平可作为口腔癌或其他恶性肿瘤的筛查指标[6]。此外，因α-酮酸结构的特殊性，它可作为一些药物的合成中间体[7]，所合成药物可用于治疗慢性肾病、恶性肿瘤、高血压等疾病。通过对体内不同组织的α-酮酸进行含量测定，能够检测和研究药物在体内的治疗作用。

目前，测定α-酮酸类化合物的分析方法主要有高效液相色谱法（HPLC） [8-11]、气相色谱法（GC）[12]和毛细管电泳法（CE）[13]。紫外检测器（UVD）是测定生物样品中α-酮酸常用的检测器，在使用这种检测器时，一般情况下会对α-酮酸进行衍生化，以便得到分离度高、响应值强的分析图谱。本研究以4-硝   基-邻苯二胺（NPDA）为衍生化试剂对丁酮酸、丙酮酸以及酮戊二酸进行衍生化，其原理是邻苯二胺类化合物與α-酮酸形成喹喔啉化合物进而产生紫外吸收。通过筛选最优柱前衍生化条件，为后续测定生物样品、药品，化妆品等中的α-酮酸提供参考。

1  实验部分

1.1  仪器

ISO9001型微量电子天平，北京塞多利斯科学仪器有限公司;水浴锅，郑州长城科工贸有限公司;DG-800旋涡混合仪，鼎国昌盛生物技术有限责任公司;8453型紫外可见分光光度计，美国安捷伦公司;1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司;KQ5200B超声波清洗器，昆山市超市仪器有限公司。

1.2  试剂

丁酮酸，西格玛奥德里奇（香港）控股有限公司;丙酮酸钠，上海生工生物工程股份有限公司;酮戊二酸单钾盐，上海生工生物工程股份有限公司;甲醇，色谱纯，西格玛奥德里奇（香港）控股有限公司;4-硝基-1，2-苯二胺（NPDA），阿拉丁上海晶纯试剂有限公司;浓盐酸，分析纯，上海生物工程技术有限公司;氢氧化钠，分析纯，上海生物工程技术有限公司。

1.3  溶液配制方法

1.3.1  10 mmol·L-1 NPDA溶液

称取0.006 2 g NPDA溶于4 mL甲醇中，旋涡   1 min使其充分溶解，4 ℃保存。

1.3.2  100 mmol·L-1 丁酮酸溶液

取17 μL丁酮酸纯溶液溶于883 μL超纯水中，充分混匀，4℃保存备用。

1.3.3  10 mmol·L-1 丙酮酸钠溶液

称取0.004 4 g丙酮酸钠溶于4 mL超纯水中，旋涡1 min使其充分溶解，4 ℃保存备用。

1.3.4  10 mmol·L-1酮戊二酸单钾盐溶液

称取0.007 4 g丙酮酸钠溶于4 mL超纯水中，充分混匀，4 ℃保存备用。

1.3.5  0.5 mol·L-1盐酸

取1 mL 2 mol·L-1盐酸加入4 mL水中，充分混合，4 ℃保存备用。

1.3.6  0.5 mol·L-1氢氧化钠

取1 mL 2 mol·L-1氢氧化钠加入4 mL水中，充分混合，4 ℃保存备用。

2  方法与结果

2.1  检测波长的确定

丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐并没有紫外吸收，因此需检测衍生化反应前后紫外吸收波长的变化。首先，单独取500 μmol·L-1 NPDA 200 ?L装入石英比色皿中，在200～800 nm波长范围扫描，测得有2个最大的吸收波长，分别是λ1=267.0 nm，λ2=404.0 nm。然后将10 mmol·L-1的NPDA稀释至500 μmol·L-1，分别与丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐按照物质的量比1∶1在pH=3、温度45 ℃、加热时间20 min的条件下反应，分别取衍生化产物200 ?L置于石英比色皿中，在200～800 nm的范围内扫描，结果如表1所示。测得的结果都接近260.0 nm，且在260.0 nm处的峰易于辨别，因此将260.0 nm作为检测波长。

2.2  HPLC分离检测条件

液相柱 250 mm×4.6 mm，5 μmol·L-1;柱温35 ℃;流动相为甲醇和水（体积比为65∶35）;流速为0.7 mL·min-1;进样量为10 μL;检测波长为260 nm。

2.3  3种酮酸类化合物保留时间的确定

将1.3中配置的丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐母液稀释至1、500、200 μmol·L-1。

1）取1 mmol·L-1的丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐各100 μL，分别与1 mmol·L-1 NPDA 200 μL混合，再加水100 μL，3种化合物的终浓度均为250 μmol·L-1，调节pH为3，在45 ℃下均反应20 min。

2）取500 μmol·L-1的丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐各100 μL，分别与1 mmol·L-1 NPDA200 μL混合，再加水100 μL，3种化合物的终浓度均为125 μmol·L-1，调节pH为3，在45 ℃下均反应20 min。

3）取250 μmol·L-1的丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐各100 μL，分别与1 mmol·L-1 NPDA200 μL混合，再加水100 μL，3种化合物的终浓度均为50 μmol·L-1，调节pH为3，在45 ℃下均反应20 min。

上述配置了3种不同浓度的丁酮酸、丙酮酸钠、和酮戊二酸单钾盐溶液，将它们的反应产物过0.22 μm滤膜后通过HPLC法检测，方法如2.2中所述，进样量为10 μL，结果如图1所示。从图1可以看出，丁酮酸的峰保留时间在8.7左右，丙酮酸钠保留时间在5.7左右，酮戊二酸单钾盐保留时间在2.9左右。

2.4  衍生化反应条件的优化

2.4.1  pH值对衍生化反应进程的影响

取500 μmol·L-1丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐100 μL，各加100 μL的水，分别与1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物质的量比4∶1）混合，取1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，加100 μL的水，与1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物质的量比2∶1）混合，设置4组平行试验，分别调节pH值至3.0、5.0、7.0、9.0，每个pH下的溶液各配置3份，每份测定2次，45 ℃下反应20 min，反应产物过0.22 μm滤膜后，按2.2的条件测定，结果如图2所示。从图2可以看出，丁酮酸和丙酮酸钠在pH=3时的峰面积最大，为反应最适pH条件，之后峰面积随着pH的增大而逐渐减小;酮戊二酸钾盐在pH=5时的峰面积最大，衍生化反应受pH值影响较大。

2.4.2  温度对衍生化反应进程的影响

取500 μmol·L-1丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐100 μL，各加100 μL的水，分别与1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物质的量比4∶1）混合，取1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，加100 μL的水，与1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物质的量比2∶1）混合，根据2.4.1优选出来的最优pH分别调节pH，设置4组平行试验，分别在25、40、60、80 ℃条件下反应20 min，每个温度下的溶液各配置3份，每份样品测定2次，反应液冷却至室温，反应产物过0.22 μm滤膜后，按2.2方法测定峰面积，结果如图3所示。从图3可以看出，丙酮酸钠和酮戊二酸单钾盐的峰面积随着温度的升高而增加，在80 ℃时面积最大，因此最适反应温度为80 ℃;丁酮酸在60 ℃和80 ℃反应产物的峰面积差别不大，但是在80 ℃时反应产物分解得到的副产物的峰面积大于产物的峰面积，因此选择60 ℃为最优温度。

2.4.3  加热时间对衍生化反应进程的影响

取500 μmol·L-1丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐100 μL，各加100 μL的水，分别与1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物质的量比4∶1）混合，取1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，加100 μL的水，与1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物质的量比2∶1）混合，根据2.4.1优选出来的最优pH分别调节pH，设置5组平行试验，在2.4.2优选出来的最优温度下分别反应10、20、30、60、120 min，每个时间下的溶液各配置3份，每份样品测定2次，反应产物过0.22 μm滤膜后，按2.2方法测定峰面积，结果如图4所示。

从图4可以看出，丙酮酸钠加热60和120 min的峰面积变化不大，选择60 min为最优反应时间;丁酮酸和酮戊二酸单钾盐反应120 min产物峰面积最大，选择120 min为最佳反应温度。

2.4.4  物质的量比对衍生化反应进程的影响

按照物质的量比1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、    10∶1的比例取不同濃度的NPDA 200 μL 和500 ?mol·L-1的丙酮酸钠和酮戊二酸单钾盐100 μL，分别混匀，按照物质的量比1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、10∶1的比例取不同浓度的NPDA 200 μL和1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，混匀。不同比例的样品在2.4.1优选出来的最优pH、2.4.2优选出来的最优温度和2.4.3优选出来的最优加热时间条件下反应，每个比例下的溶液各配制3份，每份样品检测2次，反应产物过0.22 μm滤膜后，按2.2方法测定峰面积，结果如图5所示。从图5可以看出，丁酮酸和丙酮酸钠的峰面积随着NPDA的量增加而增加，在    10∶1条件下反应最好;酮戊二酸单钾盐在8∶1条件下反应最好，NPDA的浓度继续增大反而导致峰面积减小。

2.5  优化后标准曲线的制备

配制不同浓度的NPDA与丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐溶液，在优选出来的衍生化条件下反应，按2.2方法进行测定。各化合物的标准曲线如下：丁酮酸y=1.634 7x+22.423，R2=0.994 0，在42～666 μmol·L-1 范围内线性关系良好;丙酮酸钠y=2.589 1x-11.682，R2=0.996 4，在5～500 μmol·L-1范围内线性关系良好;酮戊二酸单钾盐y=5.202 7x+45.423，R2 =0.997 1，在5～1 000 μmol·L-1 范围内线性关系良好。

2.6  精密度检测

在上述衍生化条件优选出的反应条件下配制样品，每组均平行配制3份，每份样品连续进样2次，反应产物过0.22 μm滤膜后，按2.2方法进行测定，计算每组的平均相对标准偏差（RSD），以此来考察方法的重现性和仪器的稳定性。丁酮酸、丙酮酸钠、酮戊二酸单钾盐衍生物峰面积的RSD值分别为0.14%、0.10%、0.07%，结果表明该方法的重现性和仪器的稳定性良好。

3  结 论

邻苯二胺类化合物能够与α-酮酸反应形成喹喔啉衍生物，使α-酮酸产生较强的紫外吸收。本试验采用NPDA作为衍生化试剂进行研究，NPDA作为一种有效的柱前衍生试剂，在紫外区具有较高的灵敏度，用简单的甲醇-水混合物等流动相进行洗脱分离容易。采用单因素试验考察pH值、反应温度、反应时间、物质的量比例对α-酮酸衍生化反应的影响。结果表明，丁酮酸最佳衍生条件是pH=3、温度60 ℃、加热2 h、衍生化试剂与其物质的量比为10∶1;丙酮酸钠最佳衍生条件是pH=3、温度80 ℃、加热1 h、衍生化试剂与其物质的量比为10∶1;酮戊二酸单钾盐最佳衍生条件是pH=5、温度80 ℃、加热1 h、衍生化试剂与其物质的量比为8∶1。线性结果表明，3种化合物的线性均良好，精密度试验表明该方法的选择性和重现性均良好。

综上所述，NPDA作为衍生化试剂与α-酮酸类化合物反应，能够提高α-酮酸类化合物的检测灵敏度和准确性，实验结果可为检测生物样品、药品、化妆品等中α-酮酸类化合物提供参考。

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