拓展实验萝卜硫素质谱分析与指认

董俊杰 施琪浩 张英杰

摘      要：萝卜硫素（SFN）是蔬菜中发现的抗癌效果最好的植物活性物质。采用DFT方法在B3YLYP/6-31+G水平下计算萝卜硫素及其衍生物的羰基氧5-O的ESP电荷、NBO电荷、HIR电荷和Mulliken电荷，通过用不同的基团单取代得到17种不同衍生物，利用Chem 3D软件模拟了17种不同取代基的萝卜硫素衍生物的沸点，并通过拟合发现羰基氧5-O的NBO电荷值的相关系数值较大（R2=0.951，y=1 028.24+1 080.58x），利用信息理论指数拟合的羰基氧5-O的SGBP值的相关系数值最大（y=25.13+1.60x，R2=0.980）。还模拟了萝卜硫素及其-F代衍生物的质谱，对其谱图中的特征峰进行指认和归属，这对萝卜硫素及其衍生物的酶法合成提供了理论支持，也为材料工程与制药专业拓展实验识别其萝卜硫素衍生物以及构效关系提供了基础数据。

关  键  词：制药专业实验;密度泛函理论 ;萝卜硫素;沸点;质谱;谱学分析

中图分类号：G822.8       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）08-1643-04

Abstract： Sulforaphane （SFN） is the most potent anticancer plant active substance found in vegetables. The ESP charge， NBO charge， HIR charge and Mullliken charge of carbonyl oxygen 5-O of sulforaphane and its derivatives were calculated by DFT method at B3YLYP/6-31+G level. Seventeen different derivatives were obtained by single substitution of different groups. The boiling points of 17 different substituted sulforaphane derivatives were simulated by Chem3D software， and the correlation of the NBO charge of carbonyl oxygen 5-O was found by fitting. The value was larger （R2 = 0.951， y=1 028.24 + 1 080.58x）， and the correlation coefficient of SGBP value of carbonyl oxygen 5-O fitted by information theory index was the largest （y=25.13 + 1.60x， R2 = 0.980）. The mass spectra of sulforaphane and its derivatives were simulated， and the characteristic peaks were identified and assigned. This paper can provide a solid theoretical support for the enzymatic synthesis of sulforaphane and its derivatives， as well as basic data for the identification of sulforaphane derivatives and their structure-activity relationships in materials engineering and pharmaceuticals.

Key words： Pharmaceutical experiments; DFT; SFN; Boiling points; Mass spectroscopy; Spectral analysis

目前，胃癌等惡性肿瘤是世界上尤其老年人癌症正逐渐地演变成第一大导致死亡的原因，高发病率和高致死率的疾病之一，全球每年因胃癌而死亡的病人总数达到了千万人次以上。用化学方法防治癌症已经引起人们的关注。萝卜硫素（1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷） （Sulforaphane），又称“莱菔硫烷”，是一种异硫氰酸盐，由硫代葡萄糖苷（glucosinlates以下简称硫苷， SFN）经植物体内黑芥子酶（myrosinase enzyme）水解所得。在西兰花、芥蓝、北方圆红萝卜等十字花科植物中含量较丰富，是常见抗氧化剂，是蔬菜中所发现的抗癌效果最好的植物活性物质。萝卜硫素是一种含硫化合物，由硫苷经黑芥子酶水解而成，常温下呈黄色或者无色液体，不溶于水，但是极易溶解于甲醇、二氯甲烷、乙腈等有机溶剂，在高温和碱性条件下易分解，相对分子质量为177.3，分子式C6H11S2NO。硫苷和黑芥子酶分别稳定存在于植物组织细胞和液泡中，只有当植物组织被破坏时才能水解得到萝卜硫素。由于水解过程会受pH、温度、水分等因素影响，往往会造成萝卜硫素产量降低。尽管自然酶解法易受外界坏境影响，但可以根据萝卜硫素的化学特性，创造有利于合成萝卜硫素的酶解环境，如适宜的酶解pH=5～7，有利于合成萝卜硫素。目前已在植物中发现120 多种硫苷，十字花科作物中硫苷含量最高，植株各个部分都有分布，尤其是种子中的含量最高。植物体内硫苷含量会受外界生长环境的影响，因此萝卜硫素含量也受到外界环境条件的影响。不同植物种类其硫苷含量也不同，一般芸薹属蔬菜中硫苷的质量分数为500～2 000μg·g-1，其中青花菜中含量最高，尤其是种子和幼苗中，其硫苷含量是成熟植株的10～100 倍。因此青花菜是提取萝卜硫素的理想原料。研究表明萝卜硫素主要分布在十字花科蔬菜中。采用50、70和90 ℃ 3种不同温度常压干燥9种十字花科蔬菜食用部位， 采用HPLC测定其萝卜硫素含量。结果显示， 该9种十字花科蔬菜中萝卜硫素含量是芸薹属>萝卜属; 芸薹属中青花椰菜萝卜硫素质量分数最高， 为480μg·g-1， 花椰菜质量分数最低为35.2μg·g-1; 萝卜属中胡萝卜的萝卜硫素质量分数最高， 为80.9μg·g-1， 白萝卜质量分数最低， 为19.8 μg·g-1; 而在这3种不同干燥温度对同一样品处理中， 90 ℃烘干样品中萝卜硫素含量最高。 萝卜硫素（SFN， 图1） 是其中抗癌活性最强的一种植物提取单体药物。

2019年6月，张雪映等研究了萝卜硫素（SFN）作为内源性抗氧化的诱导剂， 在炎性疾病和脂肪肝疾病中参与氧化应激和化学保护， 表現出多种生理活性。为抗肿瘤新药研发提供物质基础[1]。2019年6月，陈娜等对花椰菜萝卜硫素是否对人体具有降糖作用， 结果发现， 花椰菜萝卜硫素具有辅助人体降糖的作用[2]。2019年6月，杨艳华等针对萝卜硫素对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其机制研究， 结果表明萝卜硫素能够显著抑制SGC-7901细胞的增殖， 促使其凋亡， 表现出时间和剂量依赖性， 萝卜硫素还能将SGC-7901细胞停留在G1期[3]; 2019年1月，冯莉芳等针对萝卜硫素对人胃癌细胞HGC27的抑制作用及其机制研究，探讨萝卜硫素对人胃癌细胞HGC27的抑制作用及其可能的作用机制[4-7]。本文将采用密度泛函理论（DFT）的方法，对其进行一元取代，得到结构不同的衍生物，利用Chem 3D 8.0分别模拟计算及其衍生物的沸点，并计算模拟沸点与电荷值之间的线性关系，得到相关性最高的关于沸点的预测方程。这一方法对于研究SFN的物化性质有着重要作用[8-9]。质谱广泛应用于各个学科领域检测鉴定各种化合物。随着各种新型电离技术的发展， 质谱（MS）技术已经成长为现代测试最有前途的分析手段之一， 尤其是在检测生物大分子及药物大分子等方面得到了极其广泛的应用和普及。本文对萝卜硫素质谱模拟，并对质谱上的特征峰进行指认和归属，这对萝卜硫素及其衍生物结构的研究提供有利的借鉴。

1  计算方法

在Chem Draw 8.0软件内画出苯妥英的平面结构图，启动Chem 3D 8.0软件，将Chem Draw 8.0画好的平面结构复制到Chem 3D 8.0中，并将苯妥英分子变成球棍模型，点击能量最低化按钮，让其优化到分子势能最低。保存其分子结构，保存为mol格式文件并命名。再将其导入GaussView 5.0.9软件中，得到的就是其立体结构。图1为萝卜硫素平面结构图。在分子结构的基础上，用取代基-R为-F，-Cl，-CH2Cl，-NO2，-CN，-CH3，-C2H5，-C（CH3）3，-OCH3，-CHO，-COCH3，-COCH2CH3，-OH，-CH2OH，-COOH，-COOCH3，-OCOCH3进行一元取代，从而得到17种不同的SFN衍生物。打开GaussView，在菜单栏中选择Gaussian Calculate Setup，在 Job Type 中选择Energy，选用方法为DFT， 基组选用6-31+G，其他保持不变。在Title自定义标题。在General中将Write Connectivity的勾去掉。在Additional Keywords中输入关键词pop=（nbo， chelpg， hirshfeld）。在Link 0的Memory Limit选择Specify， 60MV，Chkpoint File选择Dont save，其他保持不变，然后点击下方的Submit，弹出框中点击Save，保存gif文件，然后save，再点击OK，等待计算结果。

2  结果与讨论

2.1  SFN及其衍生物的原子电荷及沸点模拟

打开Chem 3D，将模拟的SFN分子导入Chem 3D中，选择菜单栏Analyze，点击Compute Properties，待弹出窗口选择Boiling Point（TB），点击OK，得出的为沸点。将17种衍生物导入Chem3D中，并用相同的方法计算模拟，得到沸点。打开GaussView，打开Gaussian Calculate Setup窗口，在Job Type中选择NMR，选用的方法为Hartree-Fock，选择6-31+G基组，自定义标题。General中将Write Connectivity勾去掉。在Link 0的Memory Limit选择Specify， 60MV，Chkpoint File选择Dont save，然后点击下方Submit，点击Save，保存命名为“1-nmr.gif”，save，再点击OK，等待计算结果。对衍生物进行相同计算方法，得到不同质谱图。利用GaussView计算SFN及17种衍生物羰基氧上NBO，HIR，ESP和Mulliken电荷值，利用Chem 3D 8.0软件对SFN及17种衍生物的沸点进行模拟，结果如表1所示。为了直观表示出电荷值的变化与沸点之间的关系，分别对羰基氧5-O的HIR，ESP，Mulliken和NBO的电荷值与沸点进行线性作图分析，从而进一步确认它们之间的关系。根据以上4幅图可以对比发现，在其4个拟合线性方程中，羰基氧5O-NBO电荷值与沸点的线性方程的R值较大（R2 = 0.951，  y =1 028.24 +1 080.58x）。

2.2  SFN及其衍生物的信息指数分析

信息理论（IT）作为数学、微电子学以及PC机的一个小分支学科，它首先由英国数学家申农（Shannon）等把描述概率分布的函数-信息（Information）-定量化而逐步发展起来的。因为IT函数量仅仅与分子中的原子电子密度及其梯度量有关联，都是它们却与密度泛函（DFT）理论和密度泛函化学活性理论（DFRT）有着天然的、紧密的内在的有机联系。将引入以下9个IT信息理论量来描述目标分子的结构与活性，进一步发展DFRT理论：香农信息熵（SS）：描述电子密度的空间离散程度。费舍尔信息熵（IF）：描述电子密度分布的锐度和浓度。费舍尔信息-拉普拉斯量的等价表示（IFL）： GBP熵（SGBP）;信息增益量（IG）：两个概率分布函数的熵差的非对称性量度;Hirshfeld原子电荷（Hirshfeld charge）： Rényi信息熵（Rn）：当n趋近1的时候，Rn演变为香农信息熵Ss。Tsallis信息熵（Tn），延展化的标准玻兹曼-吉布斯信息熵（Boltzmann-Gibbs entropy）;Onicescu信息能（En），较SS更精确的描述离差分布的物理量。以上9个IT信息熵量，均可以以分子中的原子与电子密度极其梯度作为数学概率分布函数的变量来定义的一系列IT信息理论物理量。使用 Chem 3D 软件， 构建 17个萝卜硫素酸及其衍生物的模型， 并使用 ChemDraw 8.0 进行其能量最低化; 在 GaussView 5.0.9 软件中， 对其进行构型优化， 并保存其mol格式和gif格式， 在菜单栏中选择 Calculate-Gaussian Calculate Setup， 分别计算17个衍生物的量化参数。运用 ACD Labs 6.0 软件， 得到17个萝卜硫素衍生物相对应的沸点预测值; 再用 Multiwfn 3.5 分别计算 17个衍生物的信息分子熵， 记录其所需O、H原子的熵值。最后分别将17个衍生物O、H原子的8种的熵值与得到的沸点（TB）用 Origin 8.6作图， 得到相应线性回归方程， 比较其相关系数 （R）值的大小， 确定值最大为寻找得到的预测方程。研究结果（表2）显示，氧原子GBP熵（SGBP）值与其沸点的线性相关系数最佳，R2=0.980，y=25.13+1.60x）。

2.3  SFN及其-F代衍生物的质谱分析

商品化的质谱仪（MS）用高能分子-电子能流等去轟击分子样品，使该目标分子失去外层电子变为带不同正电荷的分子离子极其键裂解碎片离子。这些不同的带电荷的正离子将具有不同的分子质量，而质量不同的正离子将在外电磁场的引导作用下到达分子离子检测器的时间也将不同，其飞行结果即为目标分子的MS质谱图。选择离子检测方式是预先选定1种或2～3种特征离子进行扫描，得出这些质荷比的离子流强度随时间变化的图形-特征离子色谱图，又称质量碎片图。这种检测方式在进行痕量物质分析时，更能显示出它们的优点。首先灵敏度高，其检测限可达5×10-14 g，比全扫描检测方式提高2～3个置级。第二个优点是可对气相色谱不能分离（即台峰）的组分进行定量测定，这是任何检测器无法比拟的。在Gaussview 5.0.9中导入模拟好的x.mol格式的分子，在Calculate界面中选用DFT方法和6-31+G基组下计算数据，并将计算后的结果数据导入Origin 6.0中，处理数据，可以做出SFN的质谱图，如图2所示。

SFN的特征峰如图2a下：在质荷比m/z为25处的峰离子强度最大，所以在此处的峰为基峰，在质荷比m/z为239处的峰为分子离子峰，在此处的峰的质荷比比较接近分子的相对分子质量。在质荷比m/z为85和86出的为苯基的碎片离子峰，在质荷比m/z为118左右的系列峰为杂环断裂的碎片离子峰。在Gaussview 5.0.9中导入模拟好的mol格式的分子，在Calculate界面中选用DFT方法和6-31+G基组下计算数据，并将计算后的结果数据导入Origin 6.0中，处理数据，做出取代基F的苯妥英衍生物，如图2b所示。用-F取代的SFN的衍生物的特征峰如下：在质荷比m/z为25处时的峰为基峰，此处的峰的离子强度最大，在质荷比m/z为230出的峰为分子离子峰，此处的峰的质荷比比较接近分子的相对分子质量。在质荷比m/z为84的峰为苯基的碎片离子峰，在质荷比m/z为118左右的一系列峰为杂环断裂碎片离子峰。

3  结 论

目前，有许多文献对萝卜硫素的制备及纯化，提取物分子离子质谱与沸点的关系等方面的研究前景做了深入的探讨。质谱及其相关技术发展较晚，相关市场在临床质谱检测应用方面仅有10年左右，类似基因测序的早期发展阶段。但是凭借其快速、准确、高通量的优势，质谱技术发展迅猛，并且获得了多个诺贝尔奖项。近年来国际上相关公司加大了质谱技术研发力度，质谱技术专利申请数呈增长趋势，且多家知名公司于2018年推出数个新型质谱仪及其应用方案。相较于国外，国内质谱技术的生产应用还不够普及。近年来，质谱产业政策利好，市场政策趋于成熟，国内市场有很大的发展空间。李臻等针对萝卜硫素对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，观察到萝卜硫素（SF）对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的迟发性超敏反应表达的影响， 探讨SF对机体免疫系统的调节机制。通过高斯软件构建了SFN和它的17 种衍生物模型，优化结构，运用密度泛函活性理论（DFRT）和信息理论指数（IT），通过计算羰基5位氧原子电荷和9种信息指数，预测了萝卜硫素及其类似分子的沸点值，建立了统一数值模型预测羧酸类、羟基类、胺类药物和类似分子的沸点值，并与用信息指数建立的预测方法进行了比较，得出以下2点结论：

1）利用DFT的方法在B3YLYP/6-31+G水平下优化萝卜硫素及其衍生物的结构，并计算了SFN及其衍生物的羰基氧5-O的ESP电荷，NBO电荷和HIR电荷和Mulliken电荷，通过计算得到相关性最好的关于预测沸点的线性方程（y=1 028.24+1 080.58x）， 其中羰基氧5-O-NBO的电荷值与沸点的线性方程的R较大（R2=0.951）;羰基氧5-O原子的GBP熵SGBP值与沸点的线性相关系数最佳（y=25.13+1.60x，R2=0.980），即相关性最高，因此我们可以用此方程来预测SFN衍生物的沸点。这一方法对SFN药物的结构研究和物化性质和开发有着重要意义。

2）以外沿电子流去轰击或其他的作用方式使被测量的样品失掉外层电子分子正离子化，形成各种质荷比（m/z）不同的正离子，然后利用分子电磁学原理与方法使正离子按不同的质荷比值发生分离并测量各种正离子的强度值，从而能够确定被测物质药品的分子质量和结分子结构。

本文对SFN及其F-SFN衍生物质谱进行模拟预测和描述，其出峰值强度大而灵敏，并指认了谱图中的特征峰。这对我院材料工程与制药专业学生今后学习SFN衍生物检测提供参考数据。

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