富锗温泉水改善4T1乳腺癌荷瘤小鼠免疫抑制状态的作用研究

骆启晗 潘珍珍 石荣珍 高建莉

温泉是一种由地壳深处受地热作用而从地下自然涌出来的泉水[1]，泉水温度超过25 ℃，富含多种矿物质元素，如钾、钙、钠等，以及氡、镭等放射性元素，且温泉水中的二氧化碳、硫化氢等气体也具有医疗价值[2]。温泉水浴对多种疾病都有明显的疗效。相关研究认为温泉水浴可降低个体血压及血糖、血脂水平，辅助治疗糖尿病并发症，还可治疗呼吸道疾病、顽固性皮肤病，缓解类风湿性关节炎症状等[3]。

锗(Ge)是一种具有多种生物活性的微量元素，对人体具有广泛的防病治病等功效，被科学家称为“21世纪的救命锗”“生命的奇效元素”[4]。锗对于免疫调节、癌症预防、慢性肝炎治疗等都具有积极作用。五没食子酰葡萄糖锗(PGG-Ge)对人乳腺癌细胞MCF7等6种肿瘤细胞的增生均具有明显的抑制作用[5]；Ge-132能够有效抑制3LL肺癌细胞的迁移和生长；合成抗坏血酸有机锗倍半氧化物能够抑制S-180肉瘤的生长, 其能效可以达到与广谱抗癌药物环磷酰胺相当的水平；合成多酚锗也能够有效地抑制HepG2肿瘤细胞的生长[6]。锗元素在自然界分布广泛，在许多地区的矿泉水及地下水都发现含锗。本实验所使用的温泉水样本取自福建省清流县天芳悦潭，经ICP-MS检测，锗含量为0.01 mg/L，通过研究富锗温泉水对4T1乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长、转移的抑制作用及机体免疫功能的影响，明确其对乳腺癌荷瘤机体的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株 4T1 小鼠乳腺癌细胞株，由中国科学院细胞库提供。采用DMEM培养基(添加NaHCO31.5 g/L，青霉素1×105U/L、链霉素100 mg/L)90%，优质胎牛血清 (批号：A66E00F，Gemini，美国)10%在37 ℃、饱和湿度及5% CO2的细胞培养箱内培养，每2～3 d传代1次。

1.2 药物、试剂及仪器 注射用环磷酰胺(CTX)(江苏盛迪医药公司，批号14120525，规格200 mg/瓶，Milli-Q水配成0.67 mg/mL，-20 ℃保存)；黄芪购于浙江中医药大学附属第一医院(浙江省中医院)中药房，70%乙醇回流提取，冷冻干燥后，制备成浸膏。临用前生理盐水稀释灌胃给药。温泉水样本取自福建省清流县天芳悦潭，经ICP-MS检测，锗含量为0.01 mg/L，水样采用0.22 μm微孔滤膜过滤后-20 ℃保存，临用前解冻。细胞培养瓶T75(Nunc，批号：7133428)；DMEM高糖培养液[赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司，批号：8117065]；0.25%Trypsin & 0.25%胰酶溶液(杭州吉诺生物医药技术有限公司，批号：2017052601)；胎牛血清(GEMINI， 批 号：A66E00F)；0.4% 台 盼 蓝 溶 液(Solarbio，上海索莱宝科技有限公司，批号：20120906)；异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号：204141201)；甲醛溶液(上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20170109)；PBS缓冲液 (索莱宝，批号：113I0227)；碳酸氢钠NaHCO3(SIGMA，批号：SLBK6477V)；ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：)生理盐水(江苏苏中药业集团股份有限公司，批号：15012406)。荧光倒置显微镜(尼康)；血球计数板(玉环县求精医用仪器厂)；小动物吸入式麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；超净工作台(上海博迅实业有限公司)；恒温培养箱(美国Thermo scientific)；低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；全自动血液分析仪(希森美康株式会社)。小鼠手术器械包购自世界精密仪器有限公司(美国，批号03-D)；0.1 mL灭菌注射器，由上海奥尔科特生物科技有限公司提供；游标卡尺购自上海美耐特实业有限公司。

1.3 BALB/c小鼠乳腺癌模型的建立 BALB/c小鼠购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2013-0016，4～6周龄雌性小鼠，体质量(18±2)g，SPF级，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，自由饮食，维持12 h/12 h明暗周期。适应性喂养一周后，选取健康BALB/c小鼠36只，气麻机2%的异氟烷麻醉小鼠后，除空白对照组外的小鼠均于右侧倒数第二对乳腺脂肪垫下接种1×107/只4T1细胞悬液，每只注射100 μL细胞悬液，制备小鼠4T1乳腺癌荷瘤模型。

1.4 动物分组及给药方法 造模成功后，采用完全随机分组法将雌性BALB/c小鼠分为模型组、CTX组、温泉水组、黄芪对照组，每组8只，另设未造模小鼠8只为正常组。造模48 h后，模型组皮下注射给予质量浓度为0.009 g/mL的生理盐水200 μL/次/只，CTX组腹腔注射给予CTX 100 mg/kg，黄芪对照组灌胃给予30 mg/kg的黄芪提取物，温泉水组皮下注射给予200 μL/次/只。每3 d给药一次，连续给药28 d。实验期间小鼠自由采食饮水。

1.5 肿瘤体积、瘤重及肿瘤生长曲线检测 荷瘤小鼠造模第5天用游标卡尺第一次测量瘤体长径L(mm)和短径W(mm)，之后每5 d检测一次，根据公式：V＝(L＋W)(L)(W)(0.261 8)，计算瘤体积V(mm3)，绘制肿瘤生长曲线。给药28 d后，小鼠脱颈椎处死。剖取移植瘤，并计算肿瘤指数(肿瘤指数＝单个瘤重/小鼠体质量)；抑瘤率(%)＝(1－治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。

1.6 胸腺、淋巴结、脾脏、肺重量及指数检测 解剖小鼠取肺、胸腺、脾、腋下淋巴结。称重拍照、分别计算各个脏器系数。脏器指数＝脏器重量/小鼠体质量。

1.7 血常规及ELISA法 末次给药2 h后，取血，血常规检测各组小鼠血液内的红细胞数量(RBC)、白细胞数量(WBC)、血红蛋白(HGB)等16项血液学指标。采用ELISA试剂盒测定小鼠血清中血清白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)水平。

1.8 血涂片 取3 μL左右的血置于载玻片上，将推玻片与载玻片保持30°角，置于血滴正前方，稍微后移，血液沿推玻片散开后，匀速向前推玻片，至血液铺完血膜为止。待血膜干透后，将载玻片置于染色架上，滴加瑞氏染液试剂一3～5滴，使其覆盖血膜，染色1 min固定血片。接着滴加瑞氏染液试剂二6～10滴，用洗耳球吹气使载玻片上染液充分混合，染色8 min。之后水洗30 s，待干后拍照观察血细胞分布情况及形态变化。

1.9 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件处理，实验数据结果均用(±s)表示，每组数据进行正态性检验，符合正态性分布的多个样本均数比较采用单因素ANOVA分析，若方差齐则采用LSD检验，若方差不齐就采用Games-Howell(A)检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量及去瘤体质量的变化 荷瘤小鼠在肿瘤接种9 d后，体质量增加趋势明显，且体质量显著大于正常组小鼠(P＜0.05)；CTX组体质量明显低于模型组(P＜0.05)；而比较其他各时段各组小鼠体质量数据，发现与模型组相比，温泉水组小鼠的体质量差异无统计学意义。CTX组去瘤体质量明显低于模型组(P＜0.05)，其余各组小鼠去瘤体质量差异无统计学意义(见表1)。

2.2 小鼠胸腺、脾脏、肺指数 模型组胸腺重量和指数明显小于正常组(P＜0.05，P＜0.01)，温泉水组胸腺重量和指数明显大于模型组(P＜0.05，P＜0.05)，表现与中药黄芪组类似。模型组的肺指数明显高于正常组(P＜0.05)，温泉水组的肺指数明显高于模型组(P＜0.05)。CTX显著抑制荷瘤小鼠胸腺重量(P＜0.05)和脾脏重量(P＜0.01)，降低小鼠胸腺指数(P＜0.01)和脾脏指数(P＜0.05)，抑制脾脏坏死发生率(降低至40%)。温泉水对小鼠的脾脏重量和指数影响与模型组相比差异无统计学意义(见表2，见图1)。

表1 温泉水样本对4T1荷瘤小鼠体质量的影响[(±s)，n＝8] 单位：g

表1 温泉水样本对4T1荷瘤小鼠体质量的影响[(±s)，n＝8] 单位：g

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；温泉水组、黄芪组、CTX组剂量每3 d一次。

?组别 剂量 动物体质量 去瘤体质量接种前 Day 3 Day 9 Day 15 Day 21 Day 27正常组 NS 15.30±1.19 15.74±1.17 17.76±1.05 17.73±1.07 18.53±1.09 18.85±1.18 18.85±1.18模型组 NS 16.30±0.89 16.35±1.23 18.34±1.35 19.15±1.27 20.26±1.53△ 20.19±1.79△ 19.54±1.72温泉水组 200 μL/只 16.38±1.08 16.46±0.94 18.03±1.79 19.06±1.98 20.06±1.76 20.04±1.02 19.13±2.08黄芪组 30 mg/kg 15.69±0.67 15.85±0.8 17.73±1.25 18.56±1.25 19.58±1.43 19.30±1.20 18.45±1.17 CTX组 43 mg/kg 15.74±0.99 16.21±0.79 16.59±0.91* 16.83±0.97* 17.64±0.95* 17.70±0.85* 17.50±0.84*

表2 温泉水样本对4T1荷瘤小鼠脏器指数的影响[(±s)，n＝8]

表2 温泉水样本对4T1荷瘤小鼠脏器指数的影响[(±s)，n＝8]

注：与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；CTX组、温泉水组、黄芪组剂量每3 d一次。

?组别 剂量 胸腺重量 胸腺指数 脾脏重量 脾脏指数 肺重量 肺指数正常组 NS 53.63±10.92 0.29±0.06 86.04±6.67 0.45±0.04 153.55±13.43 0.82±0.08模型组 NS 36.98±8.00△ 0.18±0.04△△ 1 070.00±148.83△△ 5.26±0.65△△ 195.10±27.43 0.96±0.10△CTX组 43 mg/kg 18.16±7.48* 0.10±0.04** 407.96±62.86** 2.32±0.42** 189.26±12.79 1.02±0.09温泉水组 200 μL/只 47.30±13.83* 0.24±0.07* 1 104.56±112.47 5.53±0.53 215.64±25.15 1.09±0.17*黄芪组 10 mg/kg 50.56±12.64* 0.26±0.06** 978.29±127.51 5.08±0.64 197.25±25.78 1.02±0.09

2.3 小鼠肿瘤体积和瘤重、转移率和转移灶数在整个肿瘤生长期，温泉水组的肿瘤体积均低于模型组，但未见差异有统计学意义。肿瘤接种28 d后，温泉水组肿瘤的瘤重与模型组和中药黄芪组相比，差异无统计学意义。值得注意的是，与模型组相比温泉水组小鼠的肺转移灶数量相对较少，转移灶较小，肺转移发生率降低(见表3)。

2.4 荷瘤小鼠外周血常规和血清IL-10水平 标准曲线y＝0.003 3x+ 0.018 8，R2＝0.998 4，计算得到实际浓度，血清IL-10水平从(221.52±72.90)降低到(151.44±34.67)(P＜0.05)，提示富锗温泉水对荷瘤小鼠血清IL-10的水平有显著抑制作用。此外，温泉水皮下注射显著降低荷瘤小鼠增加的嗜碱性粒细胞数(P＜0.05)和血红蛋白分布宽度(P＜0.05，见表4)。

表3 温泉水样本对4T1小鼠肿瘤体积、重量及转移率的影响[(±s)，n＝8]

表3 温泉水样本对4T1小鼠肿瘤体积、重量及转移率的影响[(±s)，n＝8]

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 肿瘤体积/mm3瘤重/g 肿瘤指数/% 抑瘤率/%给药6 d 给药12 d 给药18 d 给药24 d模型组 56.15±17.25 197.03±83.01 437.53±165.61 741.11±331.24 0.85±0.19 4.18±0.83 CTX组 24.86±11.86* 34.73±13.59** 71.82±22.30** 128.87±45.73** 0.20±0.09** 1.16±0.52** 76.47温泉水组 46.99±20.29 186.12±81.01 411.55±141.17 732.07±210.80 0.91±0.13 4.62±1.00 -7.06黄芪组 61.24±14.38 197.14±66.26 454.19±104.56 757.12±253.02 0.85±0.11 4.41±0.56 0组别 肺转移灶数目/个 转移率总转移灶数 ＜2 mm ＞2 mm 平均转移灶数模型组 45 35 10 5.6 8/8 CTX组 0 0 0 0 0/8温泉水组 19 16 3 2.71 7/8黄芪组 22 18 4 2.75 7/8

表4 温泉水样本对4T1荷瘤小鼠血常规的影响[(±s)，n＝8]

表4 温泉水样本对4T1荷瘤小鼠血常规的影响[(±s)，n＝8]

注：与正常组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

?组别 白细胞、单核、淋巴细胞相关指数WBC/(109·L-1) LYMPH/(109·L-1) MONO/% LYMPH/(109·L-1) MONO/%正常组 3.50±0.10 2.30±0.77 0.03±0.01 65.10±9.45 0.95±0.26模型组 219.28±47.21△△ 11.87±3.97△△ 2.88±2.00△△ 5.45±1.49△△ 1.40±1.22 CTX组 13.32±7.24** 1.08±0.60** 0.08±0.02** 9.40±5.08 0.78±0.55温泉水组 205.68±28.78 13.76±2.56 1.77±0.64 6.75±1.39 0.88±0.38黄芪组 223.30±46.51 12.14±1.09 2.66±0.53 5.63±1.24* 1.23±0.33组别 粒细胞相关指数NEUT/(109·L-1) NEUT/% EO/(109·L-1) EO/% BASO/(109·L-1) BASO/%正常组 0.75±0.43 20.13±5.75 0.41±0.27 13.23±10.35 0.00±0.00 0.18±0.17模型组 197.23±46.52△△ 89.65±3.24△△ 2.80±0.49△△ 1.30±0.22△△ 5.95±4.29△ 2.53±1.18△△CTX组 11.49±6.60** 83.2±9.64 0.51±0.08* 5.28±4.1 0.09±0.07* 0.60±0.16**温泉水组 183.58±27.45 89.17±1.35 2.27±0.44 1.13±0.31 2.60±0.92 1.23±0..25*黄芪组 201.95±45.42 90.25±1.74 2.35±0.66 1.05±0.30 2.87±1.27 1.23±0.31*组别 红细胞相关指数RBC(1012·L-1) HGB/(g·L-1) HDW/(g·L-1) MCH/pg正常组 9.81±1.00 159.00±17.53 18.30±1.22 16.15±0.19模型组 9.14±0.24 140.75±5.19 21.80±1.88△△ 15.38±0.31△CTX组 7.51±0.86* 126.75±13.74 25.08±1.70** 16.88±0.36**温泉水组 9.01±0.59 135.50±9.04 19.65±1.24* 15.05±0.19黄芪组 9.01±0.55 133.75±7.89 19.88±0.43* 14.88±0.50*

2.5 温泉水对乳腺癌小鼠外周血细胞形态的影响 血涂片结果显示，乳腺癌荷瘤小鼠的中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞增多，且中性粒细胞胞核分叶少，这种现象可能是由于乳腺癌晚期，肿瘤组织炎性细胞及炎性因子浸润，外周血内炎症细胞增多。温泉水给药小鼠的中性粒细胞数量减少且胞核分叶多，改善肿瘤诱发的慢性炎症状态。但未出现黄芪组所示，增加嗜酸性粒细胞数量的功效，说明温泉水可能具有改善肿瘤免疫抑制相关免疫细胞数量的作用，但不能增加机体免疫正调控相关的免疫细胞的数量(见图2)。

图2 各组有代表性的小鼠血涂片(200倍)

3 讨论

温泉在预防保健、疾病治疗、促进康复等方面都有显著的效果[3]。有研究指出，温泉水疗对高血压、哮喘、糖尿病等疾病均有一定的疗效，还有助于减轻焦虑、急躁等负面情绪，提高睡眠质量，其可以通过自身的物理效应和化学效应给人体健康带来积极影响[7]。温泉水中的化学物质或微量元素，能刺激人体自主神经，调节内分泌及免疫系统，从而起到治疗作用[1]。在本研究中，富锗温泉水表现出较好的乳腺癌辅助治疗作用。黄芪为临床肿瘤辅助治疗的常用中药，能广泛调节机体免疫系统[8]，改善术后身体状态，抑制肿瘤标志物水平，降低肿瘤的复发和转移[9]，且黄芪多糖对乳腺癌化疗患者具有增效减毒作用[10]。为了更精确地观察温泉水对荷瘤机体的作用，本实验采用荷瘤小鼠皮下注射含锗温泉水的方法，并设置阳性药CTX和中药黄芪为对照组，以进一步明确其对荷瘤机体免疫功能的影响。

乳腺癌是女性发病率最高的肿瘤类型，传统化疗药物对机体损伤较大，并且会破坏机体自身的免疫功能。本研究结果显示，CTX显著抑制小鼠体质量增长，而温泉水和黄芪对小鼠体质量均无明显影响，提示含锗温泉水基本上无毒，无副作用。肺转移是乳腺癌最常见的内脏转移之一[11]，温泉水组小鼠的肺转移灶数量明显减少，且转移灶较小，肺转移发生率降低，说明温泉水有抑制乳腺癌肺转移的作用。胸腺是维持外周免疫的重要器官，为T细胞前体发育为成熟的T淋巴细胞提供了重要微环境[12]，其皮质分泌多种胸腺素，参与生物体的免疫功能，特别是细胞免疫功能。实验结果显示，温泉水组的胸腺质量和指数显著高于模型组，接近于正常组，提示富锗温泉水能对抗肿瘤引起的胸腺萎缩，保护胸腺的免疫功能；但对脾脏无明显影响，不能抑制脾脏的肿大。鉴于温泉水对小鼠肿瘤体积、重量无显著作用，表明富锗温泉水主要通过免疫调节作用对抗乳腺癌转移，而非直接抑制肿瘤的生长。

IL-10是一种抗炎细胞因子，在维持免疫稳态、预防免疫介导的炎症性疾病和增强对病原体的免疫应答等方面起着至关重要的作用[13]。IL-10最初被称为“细胞因子抑制因子”，因其对T辅助细胞产生的细胞因子具有抑制作用，几乎由所有的白细胞以及乳腺、肾脏、结肠、胰腺、恶性黑色素瘤和神经母细胞瘤等人类肿瘤细胞产生[14]，并且在多种恶性肿瘤中呈高表达。IL-10 能通过抑制抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)的活化作用产生对T 细胞的抑制效应来形成免疫抑制环境，从而诱导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长和转移[15]。温泉水对荷瘤小鼠血清IL-10的水平有显著抑制作用，提示其改善荷瘤小鼠的免疫抑制状态。

综上所述，富锗温泉水能够保护荷瘤小鼠胸腺免疫功能，抑制4T1肿瘤的肺转移，并能改善机体的免疫抑制状态。此外，其多项实验结果均与黄芪对照组相似。在实际应用过程中，温泉还起到肿瘤热疗的效益，热疗作为一种疗效明确的肿瘤治疗手段，正在得到越来越多的医生和患者关注和承认。肿瘤细胞对热更加敏感，且肿瘤区域散热较慢，所以可通过热疗改变肿瘤区域的温度致使肿瘤细胞死亡[16]。因此采用42～45 ℃富锗温泉水温浴的最终综合抗肿瘤效果可能优于单独皮下给药模拟的表皮吸收效果。本实验仅初步研究了富锗温泉水对荷瘤机体的免疫调节作用，尚未开展全面的抗肿瘤药效学评价和相关机制研究，且未能结合温泉的热疗作用验证富锗温泉水浴疗的综合效果。在后续研究中，将基于本研究结果，开展多剂量、多时间点的药效学观测，并采用富锗温泉水制备细胞培养基，从细胞水平验证其对肿瘤相关的免疫细胞功能抑制的作用及机制。