ER和TGF-β1在宫腔粘连患者中的表达及其相关性的研究

杜 娟，康卉娴

对于宫腔粘连(IUA)的发病机制，国内外大多数研究支持低雌激素状态及纤维细胞活跃学说，其中雌激素是一种类固醇激素，能促进子宫内膜增生，并通过与多种细胞因子的调控来参与宫腔粘连形成，而雌激素的生理学效应受雌激素受体调节。转化生长因子-β1(TGF-β1)是导致组织器官纤维化的重要影响因子。本文通过研究正常子宫内膜组织与宫腔粘连患者子宫内膜组织中ER及TGF-β1的表达水平，分析ER及TGF-β1在IUA形成中的作用，探讨IUA形成机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：研究组为2016年1月-2019年7月在银川市妇幼保健院生殖中心行宫腔镜检查发现宫腔粘连者60例，平均年龄(31.4±3.79)岁，中度30例，重度30例；对照组45例为因不孕症行宫腔镜检查未发现宫腔粘连者，平均年龄(30.6±3.17)岁。根据中国IUA诊断分级评分标准分组[1]：①0～8分为轻度粘连；②9～18分为中度粘连；③19～28分为重度粘连。该项研究已经银川市妇幼保健院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 标本收集：月经干净3～7 d，实验组及对照组在正常子宫内膜组织中钳取适量的内膜组织；-70℃冰箱冻存。

1.3 检测方法：①采用qRT-PCR检测实验组及对照组子宫内膜中ERmRNA及TGF-β1mRNA表达:利用Trizol法提取总RNA,以总RNA为转录模板，利用反转录试剂盒反转录合成cDNA,利用荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增反应，引物设计按照GenBank数据库检索目的序列，由上海生工生物工程有限公司设计合成。各样品相对定量分析结果,根据RealTimePCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品(以1为对照样本)相对定量结果。② 采用免疫印迹法检测各组子宫内膜中ER及TGF-β1蛋白的表达：提取总蛋白并测其浓度，SDS-PAGE每个泳道分别加入50μg蛋白进行电泳；根据各目的蛋白分子量切胶，并转至PVDF膜上，TBST洗膜后用5%脱脂牛奶进行封闭，相应分子量范围的PVDF膜分别用抗人ER及TGF-β1一抗孵育，一抗孵育结束后，敷上二抗进行孵育，在利用发光液显色，图像分析软件分析目标条带光密度值，统计各组蛋白表达量。

2 结果

2.1 对照组、中重度宫腔粘连组一般情况比较：2组间年龄、基础性激素水平及BMI差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 对照组中、重度宫腔粘连组一般情况比较

2.2 对照组中、重度宫腔粘连组ERmRNA水平、ER蛋白水平、TGF-β1mRNA及TGF-β1蛋白水平的比较：重度IUA组ERmRNA较对照组低，且差异有统计学意义(P<0.05)，中度IUA组ERmRNA较对照组低，且差异有统计学意义(P<0.05)，但重度IUA组ERmRNA与中度IUA组ERmRNA间差异无统计学意义(P>0.05)；ER蛋白在对照组、中度IUA组及重度IUA组依次降低，且两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；TGF-β1mRNA在对照组、中度IUA组及重度IUA组依次增高，且两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；重度IUA组TGF-β1蛋白较对照组增高，且差异有统计学意义(P<0.05)，中度IUA组TGF-β1蛋白较对照组增高，且差异有统计学意义(P<0.05)，但重度IUA组TGF-β1蛋白与中度IUA组TGF-β1蛋白间差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 对照组中度组及重度组中ERmRNA、ER蛋白、TGF-β1mRNA及TGF-β1蛋白水平的比较

2.3 ER与TGF-β1在子宫内膜组织中表达水平相关性：将3组中ERmRNA与TGF-β1mRNA进行相关性分析显示，ERmRNA与TGF-β1mRNA呈负相关(r=-0.643,P<0.05)。将3组中ER蛋白与TGF-β1蛋白进行相关性分析显示：ER蛋白与TGF-β1蛋白呈负相关(r=-0.478,P<0.05)。

3 讨论

雌激素是一种类固醇激素，在人体靶组织具有分布广泛、调节功能多样的特点，是调节月经，促进子宫内膜再生修复的关键因素，主要通过与子宫内膜雌激素受体特异性结合后，再结合位于目标基因启动子宫的雌激素反应元件从而发挥作用。国内外研究表明IUA患者子宫内膜中ER表达异常，但结果不尽相同。有研究表明与正常子宫内膜相比，IUA患者子宫内膜ER表达水平增加[2]，陈海燕等的研究结果与之相同[3]，但徐洁等的研究发现与正常子宫内膜相比，IUA患者子宫内膜ER表达水平下降[4]，尚雪等的研究结果与之相同[5]。而本研究得出结果是：重度IUA组及中度IUA组ERmRNA水平均较对照组下降；ER蛋白水平从对照组、中度IUA组至重度IUA组依次下降，推测子宫内膜基底层受损时，ER表达下降，直接降低子宫内膜对雌激素的敏感性和反应性，导致子宫内膜修复不良，形成IUA。

TGF-β1是目前已知的最主要的促纤维形成细胞因子。TGF-β1 主要通过TGF-β1/Smad通路发挥致纤维化的作用，其通过与TGF-β1受体结合，诱导Smad2、3磷酸化，促使胶原蛋白等细胞外基质生成增加，最终促使纤维化形成。相关研究表明，与正常子宫内膜相比，IUA患者子宫内膜中TGF-β1表达水平增加[6-9]。本研究也发现TGF-β1mRNA从对照组、中度宫腔粘连组及重度宫腔粘连组依次增高；重度IUA组及中度IUA组TGF-β1蛋白水平均较对照组增高，提示TGF-β1/Smads通路在宫腔纤维化发生发展过程中起到重要作用。

本研究发现3 组患者子宫内膜组织中TGF-β1与ER呈负相关，推测TGF-β1与ER异常表达共同作用于宫腔粘连的形成过程。然而本实验为回顾性研究，且样本数量较小，临床上还需要大样本研究来明确TGF-β1和ER异常表达在宫腔粘连发生发展过程中的分子生物学活性，为宫腔粘连的分子生物学靶向治疗奠定基础。