丹皮酚通过上调miR-424-3p和抑制PI3K/AKT信号通路影响肝癌细胞的生长和迁移*

孙新锋，韩志毅，冯文杏，马文峰，张 卫，周小舟

［广州中医药大学第四临床医学院（深圳市中医院）肝病科，广东深圳518033］

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC；简称“肝癌”）是全球第六大最常见的恶性肿瘤，更是导致肿瘤相关死亡的第三大原因［1］。由于肝癌的早期有效诊断较为困难，仅20%肝癌患者能够通过肝移植、手术切除或消融治疗，部分患者甚至出现复发或转移；晚期肝癌患者预后较差，死亡率高［2］，因此探讨新的辅助疗法至关重要。丹皮酚（paeonol，Pae）别名牡丹醇，是牡丹花根皮提取物的主要活性成分，具有镇静催眠、解热镇痛、抗炎、抗氧化等多种药理和生理作用［3］。此外，丹皮酚还具有抑制肿瘤形成、降低肿瘤转移能力的作用［4-5］。但丹皮酚对肝癌细胞转移的影响尚不清楚。微小RNA-424-3p（microRNA-424-3p，miR-424-3p）是一种与肝癌相关的关键mi‑croRNA，与端粒维持、蛋白泛素化、组蛋白代谢等多个生物学过程密切相关［6］。研究显示白藜芦醇通过上调 miR-424-3p 表达促进卵巢癌细胞凋亡［7］，但miR-424-3p 在肝癌中的作用并未被阐明。我们推测丹皮酚对肝癌的抗肿瘤作用可能与调控miR-424-3p表达有关，因此本研究通过观察丹皮酚对肝癌细胞活力、迁移能力及miR-424-3p表达的影响，初步揭示丹皮酚抗肿瘤作用的分子机制，以期为丹皮酚在肝癌辅助治疗中的应用奠定理论依据。

材料和方法

1 细胞与试剂

人HCC细胞株Hep3B购于中国科学院细胞研究所。DMEM 培养基和胎牛血清购于HyClone；Lipo‑fectamineTM2000、青-链霉素双抗和Trizol 试剂购于Invitrogen；Transwell 小室购于BD；抗磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗体和抗磷酸化的蛋白激酶B（phos‑phorylated protein kinase B，p-AKT）抗体购于上海赛信通公司；抗细胞周期素D1（cyclin D1）抗体、抗基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗体、抗MMP9 抗体及辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG 购于上海艾博抗公司；miR-424-3p 模拟物（miR-424-3p mimics）、模拟物阴性对照（miR-NC）、抑制物阴性对照（anti-miR-NC）和miR-424-3p 抑制物（antimiR-424-3p）由上海吉玛制药公司提供；细胞计数试剂盒 8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购于上海碧云天公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养和实验分组 采用含10%胎牛血清及1%青-链霉素双抗的DMEM 培养基于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养Hep3B 细胞。取对数生长期的Hep3B 细胞进行实验，采用含不同浓度（50、10、200 和400 mg/L）丹皮酚的细胞培养液干预Hep3B 细胞24 h，CCK-8 法检测细胞活力，计算细胞相对活力，以确定丹皮酚的最佳使用浓度。将细胞分为：正常对照（normal control，NC）组（正常培养的Hep3B细胞）、丹皮酚组（采用丹皮酚浓度为200 mg/L 的细胞培养液干预细胞24 h）、miR-NC 组（将miR-NC 瞬时转染至Hep3B 细胞）、miR-424-3p 组（将miR-424-3p mimics 瞬时转染至Hep3B 细胞）、丹皮酚+anti-miRNC 组（转染 anti-miR-NC 同时采用 200 mg/L 的丹皮酚干预处理）和丹皮酚+anti-miR-424-3p 组（转染an‑ti-miR-424-3p 同时采用200 mg/L 的丹皮酚干预处理）。细胞转染按照LipofectamineTM2000 使用说明书步骤进行。

2.2 RT-qPCR 检测miR-424-3p 的表达水平 待细胞按照上述分组进行干预后，弃去细胞培养液，PBS洗涤细胞3 次，采用Trizol 试剂提取细胞RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度，调整A260与A280比值在1.8～2.0 之间。按照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，随后进行实时定量PCR 扩增。miR-424-3p 的上游引物序列为 5′-CGCAAAACGTGAG‑GCGCT-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；内参照U6 的上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列为 5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。运用 2-ΔΔCt法分析miR-424-3p的表达水平。

2.3 CCK-8 法检测细胞活力 将Hep3B 细胞按照每孔1×104的密度接种于96孔板，按照细胞分组进行干预后，每孔加入10µL 的CCK-8 试剂，培养箱继续孵育2 h，酶标仪检测450 nm 波长处各孔的A值，换算为细胞相对活力。

2.4 Transwell 法检测细胞迁移能力 待细胞按照上述分组进行干预后，弃去细胞培养液，PBS洗涤细胞3 次，采用无血清细胞培养基调整细胞密度为1×108/L。将Transwell 小室至于24 孔板中，上室加入300 µL 细胞悬液，24 孔板下室加入500 µL 含20%胎牛血清的细胞培养液，培养箱孵育24 h 后，取出小室，棉签拭去上室未迁移细胞，4%多聚甲醛固定下室膜10 min，结晶紫染色5 min，PBS 冲洗晾干后，倒置于显微镜下拍照，随机选取5 个视野进行细胞计数，拍照，以其均值表示细胞迁移数目。

2.5 Western blot 检测 cyclin D1、MMP2、MMP2 及PI3K/AKT 信号通路相关蛋白的水平 待细胞按照上述分组进行干预后，收集各组细胞，常规方法提取细胞总蛋白，BCA 法定量后，将细胞蛋白和上样缓冲液混合，沸水浴5 min变性，按照每泳道30µg蛋白上样，进行SDS-PAGE。随后将细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶常温封闭膜1 h，再与稀释的Ⅰ抗室温孵育2 h，与稀释的Ⅱ抗室温孵育1 h 后，最后于暗室进行化学发光显色。以β-actin 为内参照，ImageJ 软件测定各目的条带的灰度值，分析cyclin D1、MMP2 和MMP2 的相对表达水平。为检测丹皮酚调控miR-424-3p 表达对PI3K/AKT 信号通路的影响，按照上述方法检测p-PI3K和p-AKT蛋白的水平。

3 统计学处理

采用SPSS 18.0 进行统计学分析。数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度丹皮酚对Hep3B细胞活力的影响

与NC 组比较，丹皮酚组Hep3B 细胞活力显著降低（P＜0.05），且随着丹皮酚浓度的逐渐增加，其对细胞活力的抑制作用逐渐增强，见图1。我们选择200 mg/L的丹皮酚进行后续研究。

2 丹皮酚对Hep3B 细胞迁移能力和miR-424-3p 表达水平的影响

与NC 组比较，丹皮酚组Hep3B 细胞的MMP2 和MMP9蛋白表达水平显著降低，细胞迁移数量显著减少，而miR-424-3p表达水平显著升高（P＜0.05），见图2和表1。

Figure 1.Effect of different concentrations of paeonol（Pae）on the viability of Hep3B cells.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.图1 不同浓度丹皮酚对Hep3B细胞活力的影响

Figure 2.Effect of paeonol（Pae）on the migration ability and the protein expression of MMP2 and MMP9 in Hep3B cells.A：the cell migration ability was determined by Transwell assay（crystal violet staining，×100）；B：the protein expression was detected by Western blot.图2 丹皮酚对Hep3B 细胞迁移能力及MMP2 和MMP9 蛋白表达水平的影响

3 过表达miR-424-3p 对Hep3B 细胞活力和迁移能力的影响

与 miR-NC 组比较，miR-424-3p 组 Hep3B 细胞miR-424-3p 的表达水平显著升高，cyclin D1、MMP2和MMP2 蛋白的表达水平显著降低，细胞活力显著降低，细胞迁移数目显著降低（P＜0.05），见图3和表2。

表1 丹皮酚对Hep3B 细胞迁移、miR-424-3p 表达及MMP2和MMP9蛋白表达水平的影响Table 1.Effects of paeonol（Pae）on migration of Hep3B cells，miR-424-3p expression，and MMP2 and MMP9 pro‑tein expression in Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 3.Effect of miR-424-3p over-expression on the migration ability and the protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in Hep3B cells.A：the cell migration ability was determined by Transwell assay（crystal vio‑let staining，×100）；B：the protein expression was de‑tected by Western blot.图3 过表达miR-424-3p 对Hep3B 细胞迁移能力及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表达的影响

4 抑制miR-424-3p 表达部分逆转丹皮酚对Hep3B细胞活力和迁移能力的影响

与丹皮酚+anti-miR-NC 组比较，丹皮酚+antimiR-424-3p 组 Hep3B 细胞 miR-424-3p 的表达水平显著降低，cyclin D1、MMP2 和 MMP2 蛋白的表达水平显著升高，细胞活力显著增强，细胞迁移数目显著增多（P＜0.05），见图4和表3。

5 PI3K/AKT信号通路相关蛋白水平的变化

与NC组比较，丹皮酚组Hep3B细胞p-PI3K和p-AKT 蛋白的水平显著降低；与丹皮酚+anti-miR-NC组比较，丹皮酚+anti-miR-424-3p 组Hep3B 细胞p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的水平显著升高（P＜0.05），见图5。

表2 过表达miR-424-3p 对Hep3B 细胞迁移能力及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表达的影响Table 2.Effect of miR-424-3p over-expression on the migration ability and the protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 4.Inhibition of miR-424-3p partially reversed the effect of paeonol（Pae）on the migration ability and the pro‑tein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells.A：the cell migration ability was deter‑mined by Transwell assay（crystal violet staining，×100）；B：the protein expression was detected by Western blot.图4 抑制miR-424-3p 部分逆转丹皮酚对Hep3B 细胞迁移能力和MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表达的影响

表3 抑制miR-424-3p 部分逆转丹皮酚对Hep3B 细胞活力、迁移及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表达的影响Table 3.Inhibition of miR-424-3p expression partially reversed the effect of paeonol（Pae）on the viability，migration ability and protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 5.The protein levels of p-PI3K and p-AKT in the Hep3B cells were determined by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs Pae+anti-miRNC group.图 5 Western blot 检 测 Hep3B 细胞中 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的水平

讨 论

据报道，全球每年约70 万人死于肝癌［8］。尽管肝癌诊疗手段不断发展，但肝癌的频繁复发和高转移率仍是影响肝癌患者生存率的主要因素。丹皮酚是一种广谱抗肿瘤药物。研究显示，丹皮酚在体内外对前列腺癌细胞生长均有抑制作用［9］；丹皮酚还可通过激活caspase-3途径和下调生存素表达诱导卵巢癌细胞凋亡［10］；丹皮酚通过下调胃癌细胞MMP2和MMP9 表达具有抑制肿瘤细胞生长、迁移和侵袭的作用［11］。此外，丹皮酚还可通过抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用［12］，但其对肝癌细胞迁移能力的影响尚未可知。本研究采用不同浓度丹皮酚干预Hep3B 细胞，结果显示丹皮酚呈剂量依赖性地抑制Hep3B 细胞活力，与既往研究结果一致［13］。进一步研究显示丹皮酚还可抑制MMP2 和MMP9 表达，降低Hep3B 细胞的迁移能力。这些结果提示丹皮酚具有抗肝癌细胞转移的作用。

miR-424-3p 在非小细胞肺癌中表达下调，与非小细胞肺癌患者病情进展和总体预后明显相关，上调miR-424-3p 明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［14］；miR-424-3p在前列腺癌中表达下调，与临床生存期和侵袭性表型显著相关［15］。本研究显示丹皮酚干预后Hep3B 细胞miR-424-3p 的表达水平显著升高，提示丹皮酚的抗肿瘤作用可能与上调miR-424-3p 表达有关。过表达 miR-424-3p 后 Hep3B 细胞 cy‑clin D1、MMP2 和 MMP9 表达水平显著降低，细胞活力和迁移能力显著降低，与丹皮酚的抗肿瘤作用一致。进一步研究显示，抑制miR-424-3p 表达可逆转丹皮酚对Hep3B 细胞活力和迁移能力的影响。这提示丹皮酚通过上调miR-424-3p表达抑制肝癌细胞的活力和迁移能力。

PI3K/AKT 信号通路在多种肿瘤存在异常活化，与肿瘤细胞的生长、代谢、增殖和转移密不可分。研究显示索菲拉尼通过抑制PI3K/AKT 信号通路活化可抑制肝脏肿瘤的生长［16］；白藜芦醇通过抑制PI3K/AKT 通路抑制肝癌细胞的增殖和迁移［17］。Xu 等［18］研究显示miR-424-3p对前列腺癌细胞的抗增殖作用可能与抑制PI3K/Akt 通路有关。此外，丹皮酚还可通过抑制PI3K/Akt通路促进放射诱导的肺腺癌细胞凋亡［19］。本研究显示丹皮酚干预后Hep3B细胞PI3K和AKT 的磷酸化水平显著降低，PI3K/AKT 信号通路受到抑制，而抑制miR-424-3p 表达可逆转丹皮酚对Hep3B 细胞PI3K/AKT 信号通路的抑制作用。这提示丹皮酚在肝癌中的抗肿瘤作用与调控PI3K/AKT通路有关。

总之，丹皮酚可上调miR-424-3p 表达和抑制PI3K/AKT 信号通路，进而有效抑制肝癌细胞的活力和迁移。本研究为丹皮酚在肝癌辅助治疗中的应用奠定了理论基础。