盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检验方法的简化与验证
2020-09-07辛伟娟史丽新孙钧儒侯世松朱希敏烟台喜旺肉类食品有限公司
□ 李 洋 辛伟娟 史丽新 孙钧儒 侯世松 朱希敏 烟台喜旺肉类食品有限公司
“瘦肉精”是一种特定的可用来减少被饲养动物脂肪、增加其瘦肉比例的药物的俗称。传统型瘦肉精一般是指β－受体激动剂，是一类人工合成的苯乙醇胺类物质，包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、异丙喘宁、氯丙那林、西马特罗与非诺特罗等，其中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺最为常见。该类药物在动物性食品中的残留会对消费者的身体造成不同程度的影响，对于易感人群危害更为严重[1—2]。2002年，β －受体激动剂被列入《食用动物禁用兽药及其他化合物清单》[3]。
现阶段，对β－受体激动剂和喹乙醇及其代谢物的检测方法较多。刘佳等[4]建立了一种检测猪肝中26种β2—受体激动剂药物残留的反相液相色谱—串联质谱方法；金玉娥等[5]也采用液相色谱—串联质谱测定了猪肉和猪肝中11种β2—受体激动剂，上述检测方法取得了比较理想的结果。但上述研究的前处理过程都比较复杂，一般包括酶解、提取、固相萃取的过程，比较费时费力。
GB/T 21313—2007[6]的检验方法中用高氯酸溶液进行提取，众所周知，高氯酸为强氧化易爆品，具有较高的危险性，在实验室使用具有较大的安全隐患。本研究对GB/T 21313—2007的检验方法进行调整，用盐酸溶液代替高氯酸溶液进行提取，简化过柱净化程序，提高实验效率，降低上机液杂峰干扰。
1 材料与方法
1.1 试验原理
试样中β—受体激动剂残留经酶解后，再用盐酸溶液提取，经过滤和离心后，上清液用MCX固相萃取柱净化，液相色谱/串联质谱仪测定，外标峰面积法定量。
1.2 试验仪器
液相色谱Agilent1200；二级串联质谱Agilent6410；万分之一分析天平；水浴锅。
1.3 试剂
甲酸（99%）；乙腈，色谱纯；甲醇，色谱纯；乙酸，分析纯，乙酸 钠（NaAc·4H2O）； 盐 酸 克 伦 特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准储备液：准确称取0.010 0 g标准品（色谱纯≥99.5%），用甲醇溶解并定容至10 mL，即可得浓度为1 000 mg/L的标准储备液，—18 ℃保存，有效期12个月。若购买的标准品为溶液，则直接稀释为标准工作液。标准工作液：根据需要，用甲醇将标准储备液配制成适当浓度的标准工作液。标准工作液应使用前配制。
2 验证过程
2.1 试验步骤
2.1.1 提取
准确称取10 g样品，加15 mL乙酸钠缓冲液（0.2 mol/L，pH=5.2），涡旋后超声10 min。再加入β—葡糖醛酸酐肽酶100 μL，于（37±1）℃震荡酶解过夜。取出冷却后，放入75 ℃水浴10 min，加入20 mL 0.2 M盐酸，涡旋，超声10 min，离心。
2.1.2 MCX柱净化
MCX柱使用前用3 mL甲醇、3 mL水活化。取样液过柱，弃去滤液，依次用3 mL水、2 mL甲醇淋洗，最后用3.5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮气吹干后，用5%乙腈水（0.1%甲酸）1 mL定容，涡旋，过0.22 μm滤膜，待测。
2.1.3 上机条件
2.1.3.1 液相色谱条件
色 谱 柱：SB—C18柱，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；柱温：40 ℃；流动相：A水（含0.1%甲酸）；B乙腈；流速：0.25 mL/min，梯度洗脱见表1。
表1 梯度洗脱表
2.1.3.2 监测离子对及能量
检测过程中的质谱参数见表2。
表2 质谱参数
2.2 验证参数
2.2.1 定性限
参 考 GB/T 21313—2007定 性 限0.1 μg/kg，以阴性样品为测试样品，盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分别为0.1 μg/kg，在相同实验条件下做3个平行样，计算信噪比、离子丰度是否满足要求。
保留时间：试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间应一致，变化范围应在±2.5%之内。信噪比：待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3）。
定性时相对离子丰度的最大允许偏差见表3。
2.2.2 定量限
参 考 GB/T 21313—2007 定 性 限0.3 μg/kg，以阴性样品为测试样品，盐酸克伦特罗、莱克多巴胺与沙丁胺醇添加水平分别为0.3 μg/kg，在相同实验条件下做3个平行样，计算信噪比、保留时间是否满足要求。
表3 定性时相对离子丰度的最大允许偏差
保留时间：试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间一致，变化范围应在±2.5%之内。信噪比：待测化合物的定量离子的重构离子色谱峰的信噪比赢大于等于10（S/N≥10）。
2.2.3 回收率
以阴性样品为测试样品，盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分别为0.3、0.6、1.0 μg/kg与3.0 μg/kg，每个水平在相同实验条件下做6个平行样，计算回收率、相对标准偏差。
2.2.4 精密度
以阴性样品为测试样品，盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分别为0.3、0.6、1.0 μg/kg与3.0 μg/kg每个水平在相同实验条件下做6个平行样，计算实验变异系数。
2.2.5 线性范围
分别取 0.1、0.8、1.5、2.0 μg/L与3.0 μg/L的标准溶液进行测定，制作标准曲线。
3 结果与分析
3.1 定性限
按照试验步骤，对阴性样品进行加标，信噪比、相对离子丰度偏差如表4。
3个平行样的保留时间、信噪比、相对离子丰度均满足要求，能达到要求的定性限。
3.2 定量限
按照试验步骤，对阴性样品进行加标，信噪比、相对离子丰度偏差如表5。
表4 定性限相关参数
表5 定性限相关参数
3个平行样的保留时间、信噪比、相对离子丰度均满足要求，能达到要求的定性限要求。
3.3 回收率
按照实验要求，对3个项目进行了4个水平的添加回收，具体数据见表6～8。
4个添加水平的回收率均能满足GB/T 27404—2008中 的 被 测 组分含量＜0.1 mg/kg时回收率在60%～120%要求。
3.4 精密度
对不同添加水平的样品在相同实验条件下做6个平行样，计算变异系数。具体数据见表9～11。
表6 沙丁胺醇回收率
表7 莱克多巴胺回收率
表8 盐酸克伦特罗回收率
表9 沙丁胺醇精密度相关数据
表10 莱克多巴胺精密度相关数据
表11 盐酸克伦特罗精密度相关数据
所添加水平的结果符合GB/T 27404—2008 中规定的 10 μg/kg 以下变异系数小于21%的要求。
3.5 线性范围
分别取 0.1、0.8、1.5、2.0 μg/L与3.0 μg/L的标准溶液，制作标准曲线，见图1～3，相关系数R2均大于0.999，盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的浓度在0.1～3.0 μg/L的范围内与响应值呈线性关系。
图1 沙丁胺醇标准曲线
图2 莱克多巴胺标准曲线
图3 盐酸克伦特罗标准曲线
4 结论
经过上述参数验证，本研究所采用的检测方法，符合GB/T 21313—2007、GB/T 27404—2018的要求，可以用于动物源性食品中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的检测。本方法安全性高，操作快捷简单，灵敏度较高，重复性好，能够用于应急检测或日常猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺残留的监测，也为动物源食品中不同性质的兽药残留的高通量快速分析检测提供了一定的技术参考[7]。
