LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎症损伤模型的建立

摘要采用LPS诱导子宫内膜上皮细胞炎症模型，通过研究细胞因子IL-1β、TNF-α mRNA的表达验证模型，为进一步对子宫内膜炎发病机理的研究和治疗药物疗效的评价奠定基础。经组织块原代培养和胰酶纯化分离得到奶牛子宫内膜上皮细胞，并通过免疫组化鉴定细胞纯度。采用0、10、30、50、100 μg/mL 的LPS分别在3、6、9、12、18 h刺激纯化后的子宫内膜上皮细胞，采用MTT法筛选出最佳刺激浓度时间为30 μg/mL，12 h，然后以最佳刺激浓度刺激子宫内膜上皮细胞，在12 h后收集细胞，最后通过荧光定量RT-PCR检测IL-1β、TNF-α mRNA的表达差异性。

关键词奶牛子宫内膜炎;子宫内膜上皮细胞;细胞因子

中图分类号S858.23文献标识码A

文章编号0517-6611（2020）15-0105-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.029

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of Inflammatory Injury Model of Endometrial Epithelial Cells Induced by LPS in Cows

CHEN Jiajia

（Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442）

Abstract The model of endometrial epithelial cell inflammation induced by LPS was used to study the expression of IL1β，TNFα mRNA，and lay the foundation for further pathogenesis of meningitis in utero treatment of research and evaluation of drug efficacy.Bovine endometrial epithelial cells （BEEC） were obtained and purified from cow uterus with primary cultured tissue explant and trypsin，and identified by immunohist chemistry.We used 0，10，30，50，100 μg/mL concentrations of LPS，respectively，after 3，6，9，12 h to stimulate purified endometrial epithelial cells，the results showed that the best situmulation concentration and time screened out by MTT method were 30 μg/mL（LPS） and 12 h respectively.BEEC were stimulated with 30 μg/mL LPS 12 h，and the cells were collected and  fluorescence quantitative RT-PCR was made in order to detect the mRNA expression differences of IL1β，TNFα.

Key wordsCow endometritis;Endometrial epithelial cells（BEEC）;Cytokines

作者簡介陈佳佳（1989—），女，河南洛阳人，实验师，硕士，从事畜牧兽医和实验技术研究。

收稿日期2019-12-03;修回日期2019-12-20

子宫是胚胎附植和孕育胎儿的场所。子宫壁由内膜、肌层和浆膜层构成。子宫内膜是激素作用的靶组织，在生殖生理研究中占据重要地位。哺乳动物的子宫内膜由上皮和固有层构成。正常情况下，子宫内膜上皮细胞和基质细胞受卵巢激素的调节发生周期性变化。奶牛分娩会对奶牛子宫内膜上皮细胞产生机械性损伤[1]，然而子宫复旧尚未完全，病原菌的污染会导致奶牛子宫内膜炎。病原微生物可引起子宫内膜上皮细胞发生一系列的病理解剖学变化，包括核染色质凝聚趋边、核膜断裂、内质网肿胀、线粒体肿胀变形[2]。在急性卡他性和化脓性子宫内膜炎中，患牛子宫内膜上皮细胞呈现不同程度的变性、坏死[3]。王洪海等[4]报道，对产后6～10 d的健康牛和急性子宫内膜患牛子宫内膜超微结构观察发现子宫内膜炎患牛相当对照组子宫内膜局部严重脱落，上皮细胞和基质细胞大量破损[4]。

在奶牛子宫内膜炎致病菌中，大肠杆菌等革兰氏阴性菌占有很大比例。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，由类脂A、非特异性核心多糖和O抗原3部分组成，其中类脂A是“毒力中心”[5]。当细菌死亡溶解或人工破坏菌细胞后释放，又称内毒素。脂多糖作为介导革兰阴性菌脓毒症的重要启动因子，通过与其受体及其调节蛋白的结合，从而诱导机体多种细胞因子、炎性介质的合成和释放，触发机体一系列病理生理过程[6]。笔者采用MTT法检测LPS对奶牛子宫内膜上皮细（bovine endometrial epithelial cells，BEEC）细胞的增殖变化，建立奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤模型，并通过检测IL-1β、TNF-α mRNA表达水平验证模型，旨在为进一步探讨LPS诱导BEEC细胞炎性损伤机制提供研究基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1细胞来源。奶牛子宫内膜上皮细胞，原代组织培养第3～4代。

1.1.2仪器。

倒置生物显微镜（日本OLYMPUS，IX71/IX2）;二氧化碳培养箱（日本SANYO，MCO-18AIC）;酶标仪（美国BIORAD，680 型）;核酸浓度测定仪（德国Eppendorf公司）;荧光定量PCR仪（美国STRATAGENE，MX3005P）。

1.1.3试剂。 胎牛血清（美国GIBCO，批号8199549）;DMEM/F12+GlutaMAX培养基（美国GIBCO，批号1354752）;O55∶B5脂多糖（Sigma 公司，L2880）牛角蛋白免疫组化试剂盒（上海研卉生物公司）;DAB Kit（北京中杉金桥生物公司）;M- mLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、RNA 酶抑制剂、dNTP（Promega 公司）。

1.2试验方法

1.2.1奶牛子宫内膜上皮细胞的原代培养及分离纯化。

1.2.1.1试验动物取样。

从屠宰场选取临床正常，产后复旧完全的荷斯坦奶牛的子宫，30 min内结扎分离2个子宫角。用无菌生理盐水（添加400 IU/mL青霉素，链霉素）保存，置于冰盒，1 h内送入实验室。

1.2.1.2奶牛子宫内膜细胞的原代培养：组织块培养法。

在超净工作台上，用剪刀剪开子宫角中段的侧壁，暴露子宫腔;随后将子宫内膜小心从子宫肌层上剥离下来，注意将肌层组织剥离干净，并放入平皿中。用添加双抗的PBS反复冲洗组织块，直至冲洗液变清亮为止。用弯头手术剪反复剪切子宫内膜至1 mm 3小块为止，离心弃去上清，加入新的培养液，吸取若干组织块，放入培养瓶中;小块相互距离以0.5 cm为宜。翻转培养瓶，置于CO 2细胞培养箱培养2～3 h后;向培养瓶中注入少量细胞培养液（DMEM/F12GlutaMAX+10%FBS+双抗），慢慢将培养瓶翻转，置细胞培养箱中培养，24 h后补加少量细胞培养液。每天显微镜下观察细胞游出情况，每隔1天换液1次。

1.2.1.3细胞计数及活力测定。

胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，取0.1 mL 10倍稀释。将稀释后的细胞悬液与0.3%台盼蓝溶液以9∶1混合均匀，滴在细胞计数板上，在3 min内，低倍镜下用细胞计数器分别记录活细胞（无色透明）和死细胞（蓝色）数量，按照以下公式计算细胞浓度和细胞活力：

细胞浓度=（4个大方格内活细胞总数/4）×104×稀释倍数（1）

活细胞率=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%（2）

1.2.1.4奶牛子宫内膜上皮细胞的分离纯化。

当组织培养8～9 d后，子宫内膜细胞呈单層铺开，用枪头小心地将组织块吹下并从培养瓶里弃去，用无Ca2+、Mg2+的PBS洗涤细胞2次，向25 mL细胞瓶里加入37 ℃预热的0.25%的胰蛋白酶溶液0.5 mL，水平晃动细胞培养瓶消化3～5 min，在倒置显微镜下观察到大多数基质细胞变圆脱壁时，用PBS漂洗以除去基质细胞，随后加入1 mL的0.25%的胰酶-EDTA消化2～3 min，用细胞培养液终止反应，轻轻吹打细胞瓶内壁，15 mL离心管收集细胞悬液，1 000 r/min下离心5 min，弃上清，加入细胞培养液，细胞计数和细胞活力计算后，按细胞浓度105个/mL接种于细胞培养瓶中，置于37 ℃、5%CO 2 培养箱中培养。

1.2.2奶牛子宫内膜上皮细胞的鉴定。

角蛋白是上皮细胞膜上的特异性蛋白，通过免疫组化法来检测细胞膜上角蛋白的表达，从而判断细胞纯化程度。经分离纯化后，得到纯度较高的上皮细胞，当融合率达到90%以上，用0.25%的胰酶-EDTA消化，传代在6孔板中，孔板中放置高压处理好的盖玻片进行细胞爬片培养。细胞生长汇合后，弃去培养液，PBS洗涤3次。4%的多聚甲醛固定15～30 min;空气干燥5 min，用眼科镊小心取出盖玻片，注意玻片正反面。PBS洗涤2次。0.5%Triton X-100（DPBS配）孵育1次20  min。PBS清洗标本3次各2  min。加入3%H 2O 2浸泡10 min，除去内源性的过氧化氢酶，PBS冲洗3次;加入3% H 2O 2浸泡10 min，除去内源性的过氧化氢酶，PBS冲洗3次;将切片放入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），微波炉中蒸煮3 min，进行抗原修复，PBS冲洗3次;加入1滴山羊血清进行抗原修复，37 ℃孵育15 min;加入1滴1∶100倍稀释的一抗，37 ℃孵育45 min，PBS冲洗5次;加入1滴生物素标记的羊抗兔IgG（二抗），37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5次;DAB显色（避光，镜下观察至棕色）;苏木精复染10 min，冲洗;封片，拍照。

1.2.3 MTT筛选LPS作用浓度时间。

胰酶-EDTA消化并收集BEEC，台盼兰染色细胞计数，调整细胞浓度为1×105 cell/mL，加入200 μL/well细胞悬液于96 孔细胞培养板，置于37 ℃、5% CO 2培养箱中培养。待细胞80%汇合后，吸取上清，PBS洗2遍后，分别加入0、10、30、50、100 μg/mL的LPS（用不含血清的无色培养基配置），分别在培养3、6、9、12、18 h后每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL，PBS溶解，用孔径0.22 mm滤膜过滤），4 h后弃掉培养液，加入100 μL DMSO，振荡混匀，使用酶标仪于490 nm波长处测定各孔的吸光值（OD）。

细胞存活率=LPS组的OD值/对照组OD值×100%（3）

1.2.4RT-PCR检测LPS对BEEC细胞因子基因水平表达的影响。常规培养细胞，经传代3次以上，当IEC-6细胞融合率在95%以上时，用0.25%的胰酶-EDTA消化后加含15%的血清的DMEM/F12GlutaMAX完全培养液。常规培养1 d后，处理前用无钙镁PBS洗2次。

BEEC细胞分为对照组、模型组且设定3、6、9、12 h 4个时间点。对照组，用DMEM/F12GlutaMAX培养;模型组，先用DMEM/F12GlutaMAX培养2 h后，用DMEM/F12GlutaMAX配制的30 μg/mL的LPS培养3、6、9、12 h。选取3～5代纯化后的BEEC，传代于六孔板中，细胞培养箱中培养，按试验分组的要求处理细胞。细胞处理完成后，弃去培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS洗涤2次，加入1  mL 预冷的Trizol，充分吹打使裂解完全，室温放置反应5～10 min。提取RNA，加入0.1 % DEPC水20～30 μL，用枪头缓慢吹吸或离心，使RNA溶解混匀，-80 ℃下保存备用。吸取1 μL使用核酸测定仪检测RNA浓度，使用RNA反转录两步法合成cDNA。

根据GenBank数据库公布的牛待测基因序列，使用Primer premier 5.0和Oligo6.0软件在其相对保守区域设计基因的特异性上下游引物，并由上海生工生物工程公司合成。引物序列见表1。引物开盖前应先离心，慢慢打开，以防干粉状引物散失，按照说明书要求加适量灭菌处理过的DEPC水溶解，关闭管盖，充分振荡5～10 min，配成100 μmol/L的贮存液，分装后-20 ℃下保存。

RT-PCR反应体系如下：1.000 μL cDNA，1.000 μL上游引物，1.000 μL下游引物，12.500 μL Brilliant SYBR Green QPCR master Mix，0.375 μL ROX，9.125 μL DEPC水。

RT-PCR反应条件如下：95 ℃预变性10  min;95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，40个循环。溶解曲线条件如下：95 ℃ 1 min;55 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s。每个样本至少重复3次独立的Real-time PCR全过程。

1.2.5数据统计与分析。使用SPSS 11.5统计软件对试验数据进行统计与分析。

2结果与分析

2.1组织块法培养的BEEC和BESC

组织培养后一般在第4天左右开始出现组织块边缘变圆，基质细胞呈梭形从组织块周围溢出，形成“细胞晕”，在第7天呈铺石状的上皮细胞游出，如图1A所示;随着培养时间的延长，BESC分裂增殖，细胞连接成束，平行排列;BEEC呈多边形，以团块形式生长，细胞连接紧密，BESC可抑制BEEC延伸生长;如图1B所示，箭头所指为2种细胞生长的交界处;当细胞晕圈宽度是组织块的半径的1～2 倍，适合分离纯化和传代。图1C为纯化后的奶牛子宫内膜基质细胞。图1D为纯化后的奶牛子宫内膜上皮细胞。

2.2免疫组化鉴定BEEC

纯化分离后的奶牛子宫内膜上皮细胞经免疫组化法检测角蛋白的表达，如图2所示，上皮细胞的细胞质呈红棕色，角蛋白表达呈阳性，初步估算上皮细胞纯度达95%。

2.3MTT筛选LPS作用濃度和刺激时间

如图3所示，30 μg/mLLPS作用12 h后，BEEC活力显著下降（P<0.05）;50 μg/mL LPS作用12、18 h后，BEEC活力极显著下降（P<0.01）;100 μg/mL LPS作用9 h后，细胞活力显著下降（P<0.05），作用12、18 h可以极显著抑制BEEC活力（P<0.01）。

筛选结果表明，30 μg/mL的LPS作用12 h后BEEC活力显著下降（P<0.05），并且随着时间的延长，30 μg/mL及其以上的浓度刺激细胞导致细胞活力极显著下降（P<0.01），故当LPS浓度为30 μg/mL作用BEEC 12 h时细胞活力形成明显拐点，3次重复试验结果一致，选定该条件作为最佳作用时间浓度。

2.4RT-PCR检测 LPS对奶牛子宫内膜上皮细胞因子IL-1β mRNA表达的影响

由图4可知，与对照组相比，30 μg/mLLPS作用子宫内膜上皮细胞3、6、9、12 h IL-1β的表达量均极显著上升（P<0.01）。

2.5RT-PCR检测LPS对奶牛子宫内膜上皮细胞因子TNF-α mRNA表达的影响

由图5可知，与对照组相比，30 μg/mLLPS作用子宫内膜上皮细胞3、6、9、12 h TNF-α 的表达量极显著上升（P<0.01）。

3讨论

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，是引起炎症反应的关键介质之一。奶牛子宫内膜是机体抵抗侵入物的第一道防线，子宫内膜上皮细胞在阻止子宫免受感染中扮演重要的角色。因此，奶牛子宫内膜上皮细胞被广泛用于奶牛子宫生殖生理或病理以及分子基因和蛋白水平发生发展机制的研究。为了保证细胞性状的稳定性，避免细胞因多次传代而老化，故选用体外原代培养3～4代纯度较高的奶牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells，BEEC）用于体外研究的细胞模型。通过LPS对细胞进行不同浓度和时间的刺激，探讨LPS对BEEC细胞增殖能力、形态学损伤的影响，以此作为建立并评价BEEC细胞体外炎性损伤模型，进一步用于后续实验研究。

MTT法作为检测细胞增殖的经典方法，灵敏度高，特异性强，结果稳定、可靠，且操作快速、简便[7-9]。该研究中采用不含血清的无色培养基配置LPS，从而既避免了血清对LPS的干扰，也避免了一般培养液中酚红成分对吸光度的干扰。查阅相关文献后，经过预试验筛选后，选取0～100 μg/mL的浓度和0～24 h作用时间的范围内继续筛选模型条件。结果表明，在6 h内，LPS作用剂量100 μg/mL内，对奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖不会产生明显的抑制作用，9 h时100 μg/mLLPS对 BEEC活力显著下降（P<0.05），12 h时30 μg/mLLPS可以显著抑制BEEC活力（P<0.05），30 μg/mL以上浓度的LPS刺激时间达12 h以上可以极显著抑制细胞活力（P<0.01），结合LPS在体内所能达到最高浓度的考虑，故选取30 μg/mL、12 h作为LPS诱导BEEC炎性损伤模型条件。这与之前报道的小鼠子宫内膜细胞体外炎症模型所用的LPS浓度为100 ng/mL差异较大，可见该炎症模型中细胞不同，LPS 作用浓度和时间差距较大[10]。在一定程度上验证了张桂林等关于10～100 μg/mL的LPS对奶牛子宫内膜上皮

细胞有不同程度的抑制作用且LPS作用呈浓度和时间依赖性的报道[11]。倒置显微镜下观察BEEC形态学变化，30 μg/mL的LPS作用BEEC 12 h，细胞一定程度的损伤，镜下观察细胞形态发现，与对照组相比模型组细胞形态学变化明显，细胞隆起，部分细胞皱缩脱落。

LPS经脂多糖结合蛋白（LBP）/CD14的识别与调控后，形成LPS-LBP复合物，与细胞表面的CD14/TLRs受体结合，通过细胞信号传导将信号到细胞核，激活NF-κB，进而调控炎症网络分子的基因转录与表达。NF-κB活化后可以诱导TNF-α、IL-1β等细胞因子的基因转录，使其产生和分泌增多，其正反馈效应可进一步激活NF-κB，进而调控IL-6、IL-8的产生和释放[12]。NF-κB活化的同时，使IκBα、P105等抑制基因的转录上调。IL-1β可激活巨噬细胞、T细胞、B细胞和信号级联反应，诱导环氧合酶-2（COX-2）和发热反应，介导炎症反应，造成组织损伤[13]。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）因最初发现其能使肿瘤组织细胞发生出血性坏死而得名，包括TNF-α和TNF-β两类。TNF-α主要是由活化的单核-巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞产生，可激活巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞等功能，导致IL-1，IL-6等炎性介质的分泌，促进组织炎症反应的进程[14]。利用30 μg/mLLPS刺激后RT-PCR检测IL-1β mRNA表达水平显著上升，TNF-α mRNA表达水平显著下降，说明LPS能启动细胞内信号传导系统，引起IL-1β、TNF-α 等炎症相关细胞因子的合成释放，从而导致奶牛子宫内膜细胞的损伤。因此，LPS浓度30 μg/mL，刺激时间12 h作为奶牛子宫内膜上皮细胞体外炎症损伤模型建立条件。

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