聚焦超声抑制慢性单纯性苔藓大鼠外阴皮肤纤维化及其机制研究

刘 瑶 范艺巾 秦 溢 李成志

外阴慢性单纯性苔藓（vulvar lichen simplex chronicus，VLSC）是一种外阴慢性、炎症性疾病，好发于中老年妇女，其发病机制尚不明确。病理特征为外阴皮肤表层鳞状上皮增生，真皮浅层胶原纤维化。目前，临床常用的治疗方法包括药物治疗和物理治疗。常规药物治疗过程漫长且易反复发作；物理治疗虽然在一定程度上有效，但复发率较高［1］。与上述治疗方法相比，聚焦超声治疗具有疗效好、安全性高等优势，但目前关于聚焦超声治疗疾病的分子机制却鲜有报道。研究［2-3］表明，转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）在真皮层纤维化过程中发挥拮抗作用，可抑制真皮层纤维化进程；B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）可抑制相关纤维化的细胞凋亡，从而在Bcl-2/Bax信号途径纤维化的过程中发挥重要的作用。本实验通过建立VLSC 动物模型并进行聚焦超声治疗，观察聚焦超声对大鼠VLSC 的治疗效果，以及治疗后大鼠外阴组织中TGF-β 和Bcl-2 的变化及真皮浅层胶原纤维化的程度，旨在探寻聚焦超声治疗VLSC的作用机制。

材料与方法

一、实验动物

健康雌性SD大鼠50只，体质量180～200 g，8～10周龄，由重庆医科大学实验动物中心提供［动物使用许可证号：SYXK（渝）2018-0003］。本实验经重庆医科大学医学研究伦理委员会批准。

二、实验方法

1.动物模型的建立及分组：雌性SD 大鼠备皮消毒后，硬毛牙刷刷至大鼠外阴皮肤充血发红。用勾线笔蘸0.5%二羟甲基丁酸（DMBA）丙酮溶液（美国Sigma公司）涂抹于外阴皮肤。每周一、三、五涂药一次，连续12 周。取外阴活检确定模型建立成功［4］的40 只雌性SD 大鼠，随机分为实验组和对照组，每组各20 只。另取10只正常SD大鼠为空白对照组。

2.治疗与干预方式：使用重庆海扶医疗科技股份有限公司海极星®CZF 超声波妇科治疗仪，治疗参数：频率8～12 MHz，焦距0～8 mm，功率0～50 W。经1.0%戊巴比妥钠腹腔麻醉SD 大鼠后，备皮消毒，治疗区域涂超声治疗专用耦合剂。实验组根据皮损的范围、程度及局部对超声辐照的反应确定辐照时间，均采用单次治疗的方式，治疗平均剂量为194.216 J；治疗头紧贴大鼠外阴皮肤，匀速直线辐照，速度为（5～10）mm/s，一般治疗60～80 s。对照组治疗过程与实验组相同，但仪器无功率输出；均治疗4 周。空白对照组大鼠不做任何实验处理。观察并比较实验组与对照组VLSC 大鼠外阴皮肤恢复情况。

三、观察指标

1.Masson 染色检测胶原纤维密度：取待检测的大鼠外阴皮肤组织切片，入重铬酸钾浸泡过夜，铁苏木素染液染色、丽春红酸性品红染色、磷钼酸染色后经甲苯胺蓝染色；1%冰醋酸分化后透明封片。Masson三色染液（武汉赛维尔生物科技有限公司）染色后真皮层胶原纤维呈蓝色，IPP 6.0 软件对切片的染色信号进行光密度分析，计算真皮层胶原纤维的平均密度。

2.免疫组织化学检测蛋白表达：取待检测的大鼠皮肤组织切片，抗原修复后避光孵育25 min，3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30 min，先后滴加相应的一抗和二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司），磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，DAB 显色液显色，复染、脱水封片。高倍显微镜（×400）下观察，TGF-β 和Bcl-2 以细胞膜和/或胞质出现棕黄色颗粒为阳性，获得图像采用软件IPP 6.0 进行光密度分析，平均光密度值代表蛋白表达的强度。

3.Western blotting 检测蛋白表达：取保存于-80℃待检测的大鼠外阴皮肤组织，研磨后加入匀浆液提取皮肤组织细胞浆或细胞核蛋白，蛋白样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离后将凝胶上的蛋白质转移至PVDF 膜上，然后加入一抗（TBST 溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST 溶解的5%BSA）和相对应的二抗（TBST 稀释比例1∶3000），最后经化学发光法显像。

四、统计学处理

应用SPSS 22.0统计软件，计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较行t检验；计数资料以频数或率表示，治疗后治愈率比较行连续校正χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、聚焦超声治疗前后VLSC 大鼠外阴皮肤恢复情况

聚焦超声治疗4周后，实验组70%（14/20）大鼠外阴皮肤恢复正常；对照组80%（16/20）大鼠继续进展为外阴低级别鳞状上皮内病变，仅10%（2/20）恢复正常。两组治愈率比较差异有统计学意义（χ2=12.604，P<0.05）。见表1。

表1 实验组与对照组聚焦超声治疗前后VLSC大鼠外阴皮肤正常情况比较 只

二、经聚焦超声治疗后各组大鼠真皮层胶原纤维密度比较

空白对照组与实验组真皮层胶原纤维密度均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P<0.05）；实验组与空白对照组胶原纤维密度比较差异无统计学意义。见表2和图1。

三、经聚焦超声治疗后各组大鼠外阴皮肤组织中TGF-β及Bcl-2蛋白表达比较

空白对照组和实验组大鼠外阴皮肤中TGF-β 表达均高于对照组，Bcl-2 蛋白表达均低于对照组，差异均有统计学意义（均P<0.05）；实验组与空白对照组大鼠外阴皮肤组织中TGF-β及Bcl-2蛋白表达比较差异均无统计学意义。见表2和图2～4。

表2 各组大鼠外阴真皮浅层胶原纤维密度及TGF-β、Bcl-2蛋白平均光密度值比较（±s）

表2 各组大鼠外阴真皮浅层胶原纤维密度及TGF-β、Bcl-2蛋白平均光密度值比较（±s）

与对照组比较，*P<0.05。TGF-β：转化生子因子β；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2

组别空白对照组对照组实验组F值P胶原纤维密度0.191±0.020*0.316±0.031 0.189±0.009*54.778<0.05平均光密度值TGF-β 0.974±0.104*0.372±0.039 0.947±0.090*84.639<0.05 Bcl-2 1.037±0.075*1.304±0.150 0.947±0.090*14.216<0.05

图1 经聚焦超声治疗后各组大鼠外阴真皮浅层胶原纤维Masson染色镜下观（×200）

图2 经聚焦超声治疗后，免疫组织化学检测各组大鼠外阴皮肤组织中TGF-β蛋白表达（×400）

图3 经聚焦超声治疗后，免疫组织化学检测各组大鼠外阴皮肤组织中Bcl-2蛋白表达（×400）

图4 Western blotting 检测各组大鼠外阴皮肤组织中TGF-β 及Bcl-2蛋白表达

讨 论

VLSC 是外阴瘙痒常见的原因之一，其病因及发病机制尚不明确。聚焦超声治疗VLSC 因其有效性好、安全性高，目前在我国已广泛用于治疗外阴上皮内非瘤样病变［5-6］。但关于聚焦超声治疗疾病的分子机制却鲜有研究。本实验旨在探讨聚焦超声治疗VLSC的作用机制。

TGF-β 和Bcl-2 蛋白均在真皮层胶原纤维化的过程中发挥重要作用［2-3］。TGF-β 是一种多肽类细胞因子，具有调节细胞增殖和分化、促进细胞外基质（ECM）形成和抑制免疫反应等作用。伤口修复过程中，TGF-β 通过减少炎症因子细胞聚集和ECM 沉积，来平衡伤口修复过程中的ECM 合成和分解，这一过程不仅可以促进伤口愈合，而且可以抑制疤痕形成和增生，同时可以调节基质金属蛋白酶-2（MMP-2）与基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1（TIMP-1）之间的平衡，促进MMP-2活性增加，使TIMP-1表达减少，从而加速ECM 的降解，使Ⅰ型胶原纤维明显减少，抑制纤维化进程［2］。本实验经免疫组织化学检测结果显示，对照组VLSC 大鼠的外阴皮肤组织中TGF-β 表达明显减少，其真皮层胶原纤维化明显，真皮层胶原纤维密度增大；而实验组大鼠表皮层由于抑制纤维化相关的TGF-β 蛋白表达增加，经聚焦超声治疗后真皮浅层胶原纤维细胞密度较对照组明显减少（均P<0.05），排列疏松。Bcl-2 蛋白家族的主要作用机制是抗细胞凋亡，主要通过线粒体外膜透膜化达到抑制细胞凋亡的目的，Bax为促细胞凋亡基因，具有拮抗Bcl-2的作用，两者的比值是细胞凋亡的决定性因素之一。VLSC 动物模型外阴皮肤组织鳞状上皮增生，上皮层细胞增多，因此Bcl-2 蛋白可能通过延迟细胞周期进程，延长细胞生长，抑制细胞凋亡而发挥作用，同时也可能与ECM 的分泌增多有关。由于Bcl-2 与Bax 的相对比值决定细胞凋亡的敏感度，Bax 表达也是细胞凋亡的关键因素之一，因此Bcl-2 蛋白通过Bcl-2/Bax 信号通路调节细胞凋亡，在皮肤组织纤维化的进展中发挥重要作用［3-4］。本实验免疫组织化学检测结果显示，对照组VLSC 大鼠外阴皮肤组织中Bcl-2 表达明显增多，其真皮层胶原纤维化明显，真皮层胶原纤维密度增大；而实验组VLSC大鼠表皮层由于促维化相关的蛋白Bcl-2表达减少，经聚焦超声治疗后真皮浅层胶原纤维细胞较对照组密度明显减少，排列疏松。由此推测，聚焦超声治疗可能通过增加TGF-β蛋白及减少Bcl-2蛋白在其表皮层的表达，抑制真皮层胶原纤维增生。另外（均P<0.05），本实验也证实了VLSC 大鼠经聚焦超声治疗后真皮浅层胶原纤维化程度减弱，其恢复程度接近于正常皮肤组织。

综上所述，聚焦超声治疗可通过影响外阴皮肤组织中TGF-β 和Bcl-2 的表达，抑制真皮浅层胶原纤维化，从而达到治疗VLSC大鼠疾病的目的。