一起疑似摄入饮食感染霍乱疫情病原体的实验室快速检测

吴莹　王银平　张群　王延东

进一步提高实验室技术水平，多种检测方法并用，切实发挥实验室检测在疫情快速准确处置中的重要作用。方法 在应用传统微生物学鉴定方法的同时，运用实时荧光PCR法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行快速鉴定。结果 此次疑似霍乱疫情被排除，导致患者发病的致病性微生物最终鉴定为副溶血性弧菌，血清型为O3：K6型，毒力基因为tlh+、tdh+、trh-，药物敏感实验均为敏感。结论 实验室多重检测技术并用，快速准确高效地为流行病学调查和医疗机构治疗提供了强有力的技术支撑。

关键词：霍乱弧菌;多重检测技术并用;快速准确鉴定;副溶血性弧菌

中图分类号：R155.5+5

霍乱是由摄入的食物或水受到霍乱弧菌污染而引起的一种急性腹泻性传染病，在《中华人民共和国传染病防治法》规定中属于甲类传染病之一，可导致人类急性感染性腹泻，主要由O1 群和O139群霍乱弧菌引起。病发高峰期主要发生在夏季，传播途径主要是粪—口传播，人感染后严重者能在数小时内造成腹泻脱水甚至死亡[1-3]。因此，对于霍乱的快速应对、精准处置、有效控制是控制疫情蔓延的必要手段。其中，实验室对病原体的快速准确鉴定，是疫情处置的关键支撑。

疫情的发生及经过

2019年8月22日早8点，淄博市疾病预防控制中心接到所辖沂源县疾病预防控制中心电话，沂源县医院8月21日晚接诊一名水样便腹泻病人，经霍乱快诊试剂检测，报告O139群快诊弱阳性。县医院立即报告县疾控中心，县疾控中心立即组织专业人员赶赴现场，进行调查处置，指导县医院按照肠道传染病进行隔离治疗并采集病人标本，带回县疾控进行检验。8月22日早7点，挑取可疑菌落进行快诊检验，仍然显示O1群弱阳性。随即，沂源县疾控中心立即报告淄博市疾控中心，并派专人专车将病人粪便及相应增菌液、分离平板上送市疾控中心进行复核检验。

实验室检测复核

实验材料

3%NaCl碱性蛋白胨水（北京陆桥技术股份有限公司）、4 号琼脂（北京陆桥技术股份有限公司）、弧菌显色培养基（科玛嘉）、TCBS琼脂（北京陆桥技术股份有限公司）、霍乱弧菌ctxAB核酸荧光PCR法检测试剂盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌三重核酸荧光PCR法检测试剂盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌诊断血清（日本生科研）、革兰氏阴性菌药敏测试板（德国Thermo Fisher）、荧光定量PCR仪（ABI7500）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（德国Bruker公司）。

标本种类及数量

复核标本3份（患者粪便碱性蛋白胨水增菌液1份、患者粪便分离弧菌显色平板和4号琼脂平板各1个），患者粪便1份。

检测方法

霍乱弧菌参照卫生部《霍乱防治手册》第六版（2013年）[4]进行;副溶血性弧菌参照GB4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[5]。

增菌：取病人粪便接种于3%NaCl碱性蛋白胨水中于37℃增菌6～8h。

分离培养：取病人粪便和复核标本（粪便碱胨水增菌液）分别划线接种于弧菌显色平板、TCBS琼脂平板和4号琼脂平板，于37℃培养18～24h。上送的复核标本（患者粪便分离平板）继续于37℃进行培养。

氧化酶试验：挑取分离平板生长的菌落进行氧化酶试验，在1～2min内试纸变为紫色判为氧化酶试验阳性，不变色判為阴性。阳性的菌落划线3%NaCl TSA平板进行纯培养。

霍乱弧菌毒力基因检测：取复核标本（粪便碱性蛋白胨水增菌液、粪便分离弧菌显色平板和4号琼脂平板上氧化酶阳性的可疑菌落）和患者粪便分别进行霍乱弧菌ctxAB毒力基因检测，具体检验方法参照试剂盒说明书。结果判定以样本检测Ct值≤34.5为阳性、Ct值≥37.5或无Ct值为阴性、Ct值在34.5～37.5范围则需对样本进行重复检测。结果说明见表1。

质谱仪鉴定：挑取上送的复核标本（患者粪便划线分离的平板生长的菌落）进行质谱仪鉴定。

副溶血性弧菌血清学鉴定：参照GB4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[5]。

副溶血性弧菌毒力基因检测：在一个PCR反应体系中同时检测副溶血性弧菌tlh、tdh、trh基因，具体检验方法参照试剂盒说明书。结果判定以样本检测Ct值≤36为阳性、Ct值≥39或无Ct值为阴性、Ct值在36～39范围则需对样本进行重复检测。结果说明见表2。

副溶血性弧菌药物敏感性实验：采用微量肉汤稀释法，按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）中推荐的弧菌药敏实验抗生素的选择原则选取8种抗生素。

结果

复核标本初步快速鉴定：复核标本进行了相应的氧化酶实验、霍乱弧菌ctxAB毒力基因检测和质谱仪鉴定，鉴定结果见表3。

菌落鉴定：挑取疑似的副溶血性弧菌经3%NaCl TSA纯化后的菌落，分别进行氧化酶实验、质谱仪鉴定和毒力基因检测，结果见表4。

血清学鉴定：对鉴定确认的副溶血性弧菌进行血清学分型，结果均为O3：K6型。

耐药检测：利用微量肉汤稀释法，经商品化药敏板鉴定，结果均为敏感。药物名称及浓度见表5。

讨论

在此次疑似霍乱疫情中，为了快速确认是否是霍乱，我们首先将病人粪便和复核样本（粪便初步增菌液、分离平板生长出的菌落）进行了霍乱弧菌毒力基因检测，利用荧光PCR方法特异性强的优势，来进行辅助判定。经过3个小时左右的实验，荧光PCR结果显示阴性。由于复核样本培养时间短，生长出的菌落形态不十分典型，为了进一步确认到底是何种致病性微生物，我们分别挑取可疑菌落进行了飞行时间质谱仪鉴定，鉴定结果均为副溶血性弧菌。副溶血性弧菌耐热性直接溶血素（tdh）或者耐热性直接溶血素相关溶血素（trh）是导致副溶血性弧菌致病的主要毒力因子[6-7]，而且O3：K6血清型是引起副溶血性弧菌感染爆发的优势血清型[8-9]。我们对鉴定的10株副溶血性弧菌进行纯化，又分别进行了毒力基因检测、血清学检测和耐药检测，毒力基因结果为tlh阳性、tdh阳性、trh阴性，血清型为O3：K6型，耐药检测均为敏感，这也与陈玉贞在山东省副溶血性弧菌生物多态性和耐药性研究[10]中相符。

在疫情的处置中，实验室的快速准确检测是重中之重。首先，在对患者粪便进行增菌的同时，可以直接划线分离选择性平板，以此来节省18～24h。其次，在细菌鉴定的传统方法中，同时运用特异性强的实时荧光PCR分子生物学技术来辅助鉴定，为传统的生化鉴定指明了方向。再次，在获得纯化后新鲜生长的可疑菌落后，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪对菌落进行鉴定，既省去了传统生化鉴定的繁琐步骤，又节约了24～48h的传统生化鉴定时间，为疫情防控和流行病学调查抢得宝贵时间。在这次的疑似霍乱疫情处置中，检验人员争分夺秒、思路明确、有条不紊，在最短的时间内上报实验结果，成功地为身在一线的流调人员流行病学调查和医疗机构的准确用药提供了可靠的技术支撑。

参考文献：

[1]胡伦文. 一起霍乱疫情应急处置的实验室检测分析[J]. 中国卫生产业， 2017（15）.

[2]杜永芳， 李华峰， 刘尚军， et al. 2017年河南省新乡市一起霍乱O139型疫情应急处置[J]. 首都公共卫生， 2018（4）：206-207，216.

[3]吴强， 王树坤， 杨汝松，等. 一起食源性O139霍乱暴发的应急处置[J]. 中国公共卫生管理， 2011（1）：107-108.

[4]肖东楼.霍乱防治手册[M].北京：人民卫生出版社，2013.

[5]中华人民共和国国家和卫生计划生育委员会.GB4789.7 - 2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验[S]. 北京：中国标准出版社，2013.

[6]胡伟昭. 副溶血弧菌：分子分型与主要耐药基因双重PCR检测[D]. 浙江大学， 2010.

[7]李薇薇， 王晓英， 郭云昌. 中国部分水产品副溶血性弧菌毒力基因的分布特征[J]. 中国食品卫生杂志， 2010， 22（3）：239-243.

[8]方伟. 2004～2007年广东省副溶血弧菌血清分型、分子特征及溯源研究[D]. 暨南大学， 2009.

[9]郑文龙[1]， 王卓[1]， 马洁[1]，等. 副溶血性弧菌病原学和分子流行病学流行特征研究进展[J]. 疾病监测， 2015， 30（4）：337-341.

[10]陈玉贞.山东省副溶血性弧菌生物多态性和耐药性研究[D].山东：山东大学， 2016.

基金项目：山東省医药卫生科技发展计划项目（2017WS562）;课题名称：副溶血性弧菌的致病性及分子生物学检测研究;

作者：吴莹，女，淄博市疾病预防控制中心卫生检验中心 主管技师，硕士，主要从事微生物检验研究。