复合纤维素酶菌剂降解禽畜粪便动力学过程研究

成福 王万能

摘要：在自然堆肥过程中，禽畜粪便熟化是一个温度不断变化的过程，当堆肥温度低于或高于微生物菌群的最适温度时，微生物产酶效率低下甚至不产酶，导致禽畜粪便堆肥过程中纤维素的降解效率较低，费时较长。研究开发了一种复合菌剂，发酵菌剂按体积比1.5∶1.5∶1∶1∶1∶1取里氏木霉、假单孢菌、近平滑假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、烟曲霉、嗜热液化芽孢杆菌的培养液共30L，混合成复合菌剂，并将其应用于堆肥降解禽畜粪便纤维素。复合菌剂中各菌种的最适产酶温度与堆肥发酵不同阶段温度相对应，可以在堆肥过程中不同发酵温度阶段都能持续产酶，促进禽畜粪便中纤维素的分解。添加菌剂后可提前提高禽畜粪便发酵堆肥纤维素酶活性的水平及其峰值，缩短堆肥发酵时间，对堆肥的适应性及腐熟效果好。

关键词：禽畜粪便;堆肥;复合菌剂;纤维素酶

中图分类号：S-3文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200815004

收稿日期：2020-07-03

基金项目：苏北科技发展计划—科技富民强县项目（项目编号：BN2015010）

作者简介：成福（1999-），男，硕士在读。研究方向：微生物与生化药学;通讯作者王万能（1971-），男，博士，教授。研究方向：生物代谢调控。

由于集约化禽畜生产迅速发展，禽畜粪便的产生量急剧增加，对环境造成了严重威胁[1]。2001年，全国禽畜粪便年排放量已高达18.84亿t，并且还在持续增加，是工业废弃物年排放量的约3.4倍。畜禽粪便中含有大量的有机物，其中纤维素含量较多[2]。禽畜粪便的随意排放会污染土壤、地下水以及对植物生长产生影响，甚至引起植物死亡[3]。目前，纤维素的处理方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法耗能高，化学法在浓酸浓碱处理后，带来新的环境问题。而生物法利用微生物产生的纤维素酶进行降解，具有反应条件温和，高效无化学污染的特性[4]，适合禽畜粪便的处理。目前，市场上已有的多种商业纤维素酶，大部分都是由木霉属和曲霉属菌株生产得到的[5]。自然堆肥禽畜粪便的熟化速度慢，并且不易起温，达不到我国堆肥无害化处理标准，添加商业纤维素酶的又使得成本较高，不利于大规模处理。若能在堆肥过程中利用纤维素降解菌降解纤维素，不但可以促进堆肥的熟化进程，而且能提高堆肥的质量。但是在自然堆肥过程中，禽畜粪便熟化过程是一个温度不断变化的过程，当堆肥温度低于或高于微生物菌群的最适温度时，微生物产酶效率低下甚至不产酶，导致禽畜粪便堆肥过程中纤维素的降解效率较低、费时较长。如，北方地区冬季温度偏低，很多微生物的活动受到抑制，不能充分发挥作用。筛选低温产纤维素酶菌可以在低温条件下高效反应提高纤维素的降解率[6]。所以需要寻找具有特殊活性的产酶菌株，耐低温、高温纤维素酶等。利用各菌种的协同作用来高效快速地降解纤维素，选取一些功能菌株进行组合获得混合菌种的复合菌剂，提高禽畜粪便中纤维素的转化效率[7]。

因此，针对现有技术不足，研究开发了一种复合菌剂，由最适低温产酶菌、最适常温产酶菌、最适高温产酶菌组成，使得菌剂各菌种的最适产酶温度与堆肥发酵不同阶段温度相对应，两者的变化曲线相拟合匹配，各菌种协同生长，形成较为稳定的产纤维素酶环境，在堆肥过程不同发酵温度阶段都能持续产酶，促进禽畜粪便中纤维素的分解，为高效降解禽畜粪便中的纤维素，提高其使用和转化效率有重要意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂

养殖场禽畜粪便，其有机质含量79%，碳氮比（C/N）16，含水量65%，pH值7.21;稻壳粉。

菌种：里氏木霉（Trichoderma reesei），购自北京中科质检生物技术有限公司;假单胞菌（Pseudomonadaceae）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 10441;近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1257;枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subspecies）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 10832;烟曲霉（Aspergillus funigatus）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 2434;嗜热液化芽胞杆菌（Bacillus thermoliquefaciens）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 20647。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、琼脂 15～20g、蒸馏水1000mL，pH 7.4～7.6。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar Medium）：马铃薯200g、葡萄糖 20g、琼脂 15～20g、蒸馏水1000mL，pH自然。

氢氧化钠：成都市科隆化学品有限公司;酒石酸钾钠：成都市科隆化学品有限公司;苯酚：成都市科隆化学品有限公司;亚硫酸钠：成都市科隆化学品有限公司;重铬酸钾：成都市科隆化学品有限公司。

1.2仪器与设备

生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂;ZHWY-2102c恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司;高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司;pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司;紫外分光光度计：上海仪电仪器分析有限公司;自动压力蒸汽灭菌锅：厦门致微仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1复合菌剂制备

复合菌剂细菌菌种由最适低温产酶菌、最适常温产酶菌、最适高温产酶菌组成。最适低温产酶菌为假单孢菌，最适常溫产酶菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种，最适高温产酶菌为嗜热液化芽孢杆菌。复合菌剂真菌菌种由最适低温产酶菌、最适常温产酶菌、最适高温产酶菌组成，其中，最适低温产酶菌为里氏木霉，最适常温产酶菌为近平滑假丝酵母菌，最适高温产酶菌为烟曲霉。取里氏木霉、假单孢菌、近平滑假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、烟曲霉、嗜热液化芽孢杆菌，其中，假单孢菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、嗜热液化芽孢杆菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基中液体培养60～72h，至活菌数均达到108个·mL-1，培养温度为28℃;里氏木霉、近平滑假丝酵母菌、烟曲霉分别在PDA培养基中培养96h，至有效活菌数均达到104CFU·g-1左右，培养温度为26℃。按体积比1.5∶1.5∶1∶1∶1∶1取调节好浓度的里氏木霉、假单孢菌、近平滑假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、烟曲霉、嗜热液化芽孢杆菌的培养液，共计30L，混合成复合菌剂，备用。

1.3.2堆肥发酵

取养殖场禽畜粪便600kg，测定其有机质含量为79%，碳氮比（C/N）为16，含水量为65%，pH值为7.21。将禽畜粪便用30kg稻壳粉调节禽畜粪便水分含量至50%～55%，堆在2m×1m×0.5m的发酵箱体中。取复合菌剂添加进发酵箱体禽畜粪便中，搅拌均匀，并覆盖薄膜保温。堆肥过程中，采用乙醇温度计测定堆温，记录堆肥温度变化。对照组取相同重量的禽畜粪便并经同样处理后堆在2m×1m×0.5m的发酵箱体中。对照组按体积比1∶1取近平滑假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌枯草亚种培养液，共计30L，添加进发酵箱体中，搅拌均匀，并覆盖薄膜保温。

1.3.3堆肥中有机质含量及碳氮比（C/N）检测

堆肥过程中，每天取样检测分析堆肥物质变化情况，样品为多点混合样。采用K2Cr2O7容量法测定各混合样的有机质含量[8]。采用国家农业标准NY525-2011测定各混合样中C/N含量[9]，并采用3.5-二硝基水杨酸显色法测定各混合样中纤维素酶活性[10]。

2结果与分析

2.1堆肥过程中温度变化

堆肥温度是从表观上判定堆肥腐熟程度的重要指标，温度通过影响微生物活性和有机物降解速率控制发酵进程。加入菌剂处理之后，试验组在堆肥过程中逐渐产生有腐熟的气味，到13d堆肥质地变疏松，堆肥由黑色变为黑褐色，表明此时熟化完成。而对照组在堆肥发酵过程中腐熟气味的产生稍晚于试验组，而且到第18天时堆肥质地才变疏松，堆肥由黑色变为黑褐色，完成熟化时间较试验组晚。在整个堆肥过程中，试验组同对照组一样，堆肥温度随时间的变化呈先上升后下降的变化曲线。菌剂中各菌种的最适产酶温度与堆肥发酵不同阶段温度相对应，两者的变化曲线相拟合匹配，各菌种协同生长，形成较为稳定的产纤维素酶环境，在堆肥过程不同发酵温度阶段都能持续产酶，促进禽畜粪便中纤维素的分解。试验组在堆肥发酵3d后，达到最高温度63℃，维持3d后，温度逐渐下降，如图1。对照组在6d达到最高温度56℃，较试验组堆肥3d就达到最高温度63℃还是有不少的差距，充分表明复合菌剂的作用加快了反应的进程。试验组与对照组相比，试验组堆肥升温早、升温快，堆肥中加入复合微生物菌剂可提高温度峰值，且高温持续时间较长，腐熟效果更好，试验组堆肥降解速率加快，纤维素降解效率提高，加快了堆肥发酵速度，缩短了堆肥发酵时间。

2.2堆肥纤维素酶活性变化

酶活性直接影响堆肥的腐熟进程和发酵的强度，畜禽粪便中含有大量难以降解的纤维素，通过对堆肥中纤维素酶活性的测定，可以了解堆肥中纤维素降解的情况。试验加入复合菌剂进行堆肥后，记录第1天初始温度。堆肥前期，堆肥温度随时间的变化而不断升高至最高温度63℃，堆肥中的纤维素酶活性随之升高，至发酵结束，纤维素酶活性保持在1.3～1.6U·g-1较高水平。至高温63℃之后，直至熟化完成堆肥中的纤维素酶下降趋势小，最后维持在1.2U·g-1的水平。而对照组堆肥中的纤维素酶活性在6d后才达到最高1.2U·g-1，表明加入复合菌剂后，可以提高纤维素酶的活力，加快反应的进行。由于试验组提前提高禽畜粪便发酵堆肥纤维素酶活性的水平及峰值，禽畜粪便发酵堆肥中纤维素酶活性峰值比传统发酵菌剂堆肥方法提前5d，且纤维素酶活性一直维持在较高水平，表明复合菌剂中各菌种积极发挥作用，协同提高纤维素的降解效率，纤维素酶活力随时间的变化曲线如图2。

2.3堆肥有机质含量及C/N变化

堆肥发酵进行熟化，取样测定发现试验组堆肥在15d后有机质含量为386.3g·kg-1，堆肥熟化完毕后有机质含量降至61%。对照组堆肥在15d有机质含量为436.8g·kg-1，堆肥熟化完毕后有机质含量降至67%。由堆肥中有机质的变化量可知，试验组与对照组相比，试验组对禽畜粪便中有机质的降解效果更好，实验组的有机质含量下降幅度较对照组更大，表明该复合菌剂可有效促进禽畜粪便中有机质的降解。C/N也是评价禽畜粪便发酵熟化度的常用方法之一，试验组堆肥C/N值熟化完毕后，测定C/N结果显示为12.6，对照组堆肥熟化完毕后C/N为14.8，表明该复合菌剂可加快堆肥熟化的进程，提高禽畜粪便熟化度。

3结论

由于本试验复合菌剂中的最适高、常、低温产酶菌具有协同关系，组成的最适产酶温度与堆肥发酵不同阶段温度相对应，两者的变化曲线相拟合匹配，各菌种协同生长，堆肥发酵过程中，各温度阶段都有最适的产纤维素微生物菌种大量繁殖，持续产生纤维素酶，使复合菌剂在不同发酵温度阶段都能持续产酶，形成稳定的产纤维素酶微环境，酶活力较为稳定，可有效促进堆肥过程中纤维素的降解，可加快堆肥熟化的进程，提高禽畜粪便熟化度，而且对堆肥的适应性及腐熟效果都要强于传统发酵菌剂堆肥。采用复合菌剂处理禽畜粪便，与传统发酵菌剂堆肥相比，該复合菌剂可以提前提高禽畜粪便发酵堆肥纤维素酶活性的水平及峰值，比传统发酵菌剂堆肥提前2～3d出现，且纤维素酶活性一直持续在较高水平，利于降解禽畜粪便中的纤维素，有助于推进农业废弃物资源化利用，在开辟新的环境治理和能源开发思路具有重要的理论和实践意义，特别是对环境保护和可持续发展将会起到决定性的作用。

参考文献

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[3] 吴淑杭， 姜震方， 俞清英. 禽畜粪便污染现状与发展趋势[J]. 上海农业科技， 2002（01）：9-10.

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[8] 李静. 土壤有机质测定方法比对分析[J]. 绿色科技， 2012（05）：203-204.

[9] NY/525-2011，有机肥料[S]. 北京： 中国农业出版社， 2011.

[10] 蒋玉俭，李新鑫，孙飞飞，等.竹林土壤中纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化[J].浙江农林大学学报，2015，32（06）：821-828.

（责任编辑周康）