格利特消毒剂对高致病性禽流感病毒的抗病毒效力*

2020-09-02霍天武李亚雄孟艳莉

国外畜牧学(猪与禽) 2020年8期

霍天武，李亚雄，孟艳莉

[1. 丹尼斯克生物科技(上海)有限公司，上海 200050；2. 上海汉联生物科技有限公司，上海 200072]

本研究的目的是测评以戊二醛为主要有效成分的消毒剂对高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)H5N1病毒亚型的消毒效果。根据美国国家环境保护局(Environmental Protection Agency，EPA)制定的关于抗病毒剂类注册产品的测试标准和方法，用稀释至使用浓度的消毒剂产品处理被病毒附着污染的物体表面，测定回收病毒的侵染能力，根据病毒侵染性的降低程度来证明消毒剂的抗病毒能力。

1 试验方法

采用载体法获得支持本研究结果的病毒学数据，该方法在美国官方分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)应用稀释法的基础上稍作修改而成。

1.1 病毒体系

HPAI病毒由美国乔治亚洲亚特兰大疾病控制中心的亚历山大克里莫夫博士(Alexander Klimov) 提供。病毒毒种为禽流感病毒 H5N1 亚型的A/VN/1203/2004株，培养于鸡胚尿囊腔中。将病毒以1∶20的比例稀释到浓度为5%的尿囊溶液中用作固体载荷。

1.2 侵染性测定(侵染性的指示剂、介质、试剂和仪器)

将病毒接种于孵化9 d～11 d的长龄鸡胚，以评估病毒的侵染能力。孵化9 d～11 d长龄鸡胚以无病原为特征，均由 Charles River 提供。鸡胚运达当天记为孵化的第0天，然后置于孵化器中孵化。孵化器温度保持在37 ℃左右，湿度为40%～70%。鸡胚每3 h借助自动旋转仪转动一次。

使用前，所有鸡胚都进行光照检查，以确定其存活状态。主要检查鸡胚的运动情况以及是否形成良好的血管系统。光照检查时，如果鸡胚没有任何运动迹象，且血管系统被破坏，则可以认为已经死亡，使用前挑出死亡鸡胚。接种前，在鸡蛋顶部喷酒精，并用鸡蛋打孔器开口，用配有1〞23 G钝尖针头的1 mL注射器接种。接种后，用胶水密封蛋壳开口。接种后的鸡蛋不再转动。

在进行侵染性测评时，每一份稀释液接种4个鸡胚。将0.2 mL待测液接种于鸡胚的尿囊腔，孵化4 d。用鸡胚的死亡情况表征病毒的侵染能力，并用Reed-Muench法计算50%鸡胚致死量的滴度(ELD50)。

1.3 合成硬水

根据AOAC法的960.25条款E合成硬水。

1.4 试验材料

1.4.1 消毒剂的准备

根据戊二醛产品应用指导制备消毒剂。将定量的产品加入容量瓶中，用硬水定容至100 mL，产品的使用量和水的硬度如表1所示。所有待测液的浓度均以戊二醛活性浓度为基准进行制备。

1.4.2 病毒膜的制备

用HBSS平衡盐溶液将病毒的尿囊溶液稀释至5%。取0.2 mL该病毒接种物均匀喷洒在23 cm2～28 cm2的玻璃培养皿底部，空气干燥形成病毒膜，用于待测产品的消毒性测定。

1.5 病毒对照膜的处理

加入2 mL的HBSS病毒对照膜，培养5 min。此额外加入的2 mL HBSS将病毒稀释10倍。经过一定的接触时间，加入2 mL中和剂(2×HBSS＋50%胎牛血清)，病毒被稀释20倍。用移液管尖端来回刮擦培养皿表面数次，重悬病毒。其他的稀释步骤均以1×HBSS为溶剂。重悬后，将病毒液以1∶5稀释。因此，接种于鸡胚中的第一个稀释浓度为1∶100或表示为10-2，其余稀释经1∶10梯度稀释获得。至于对照病毒，其毒性对照和经消毒剂样品处理后的病毒均以相同方式处理。

1.6 中和

本试验采用稀释法进行中和，具体过程如下所述：经过一定时间接触后，取2 mL的中和剂(2×HBSS＋50%胎牛血清)加入对照病毒膜和消毒剂处理后的病毒膜，形成1∶2的稀释，随后尽快稀释。加入中和剂后，用移液管尖端来回刮擦培养皿表面数次，重悬病毒。除开始加入中和剂外，其余所有稀释均以1×HBSS为溶剂。

1.7 消毒剂鸡胚毒性对照(使用不含病毒的5%尿囊液干燥膜)

对于每一批待测消毒剂，各取2 mL同样浓度产品的稀释液处理5%尿囊液膜，以此测评消毒剂对细胞的毒性效应。以上述处理病毒对照膜和经消毒剂处理后病毒膜相同的方法处理这些培养皿。按上述操作梯度稀释这些中和后的模拟侵染液，与病毒对照和经消毒处理的病毒样品同步进行鸡胚毒性测定。

1.8 中和剂对照

取0.2 mL中和后产品毒性对照的每一稀释梯度与等体积相应的病毒对照稀释液混合液，接种于鸡胚以确定其效价。如果测试病毒的毒性效价小于对照病毒的效价，说明产品经中和及稀释后仍保持活性。应从对照病毒的效价中减去中和对照的效价。从消毒剂处理后与对照病毒相比后效价的降低中减去由中和剂导致的效价降低，是消毒剂导致的病毒效价降低。由此来确定产品是否能够将病毒效价降低3log10。

1.9 检测标准

测试结果有效要求：(a) 至少4log10的病毒侵染能力从干燥的对照病毒膜中恢复；(b) 相较于对照组，测试产品至少可以使病毒效价降低3log10；(c) 在最低无毒稀释液中未检出病毒侵染性；(d) HBSS接种对照鸡胚组仍然保持活性，且没有可见的被侵染性迹象；(e) 未接种鸡胚对照仍然存活。

1.10 统计学分析(效价的计算)

病毒效价和产品本身的毒性效价以50%鸡胚致死量的负对数值(-log10ELD50)和50%鸡胚中毒剂量的负对数值(-log10TD50)表示，采用Reed-Muench法进行计算。

1.11 测试系统的认证过程

美国南方研究所始终坚持执行有关消毒剂效力测定的标准操作规程(Standard Operating Procedures，SOPs)。SOPs 涉及测试工作的诸多方面，其中包括：病毒和鸡胚等生物制剂的购买发票、登记和追踪，以备鉴定认证；病毒稀释溶剂等化学试剂的发票及使用，等等。这些程序的制定旨在记录消毒剂效力测试研究的每一步。此外，培养皿、稀释管、鸡胚和鸡胚托盘等均根据测试病毒、试验起始时间以及测试产品等进行标签。这些方法旨在记录确定测试系统。

2 结果

测试产品的相关数据见表2。

1000mg/kg和500 mg/kg的格利特消毒剂稀释液均可杀灭超过3log10的病毒量，在最低无毒稀释液中未检出存活的病毒。对照病毒的效价为105.3。在较高浓度的格利特消毒剂中，中和对照降低了病毒的(2log10)效价，说明加入中和剂和稀释液后，产品依然具有活性。因此，经1 000 mg/kg的格利特消毒剂处理后，病毒效价的降低扣除中和剂引起的效价降低后达不到3log10，而在500 mg/kg浓度下，产品显然可以达到降低3log10的滴定度并且在最低无毒稀释浓度中无病毒残留的要求。因此，1 000 mg/kg的浓度可以视为通过测试，因为500 mg/kg的浓度可通过测试。