FOXO3a蛋白对脑缺血损伤大鼠细胞自噬的影响研究

周乃强，姚杨玲，黄坚毅

缺血性脑损伤属于脑血液循环障碍性疾病[1]。一般临床表现为运动障碍如偏瘫以及言语不清等，有些还会造成智力障碍[2]。FOXO3a蛋白可以调控细胞内部环境的稳定，B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)与Bax是相互对立的一对基因，与细胞凋亡之间有密切关联，对神经系统有重要作用。本研究通过检测脑缺血性大鼠FOXO3a蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达水平，探究其在脑缺血性大鼠中的水平变化及对大鼠神经功能和细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 研究动物与分组 选取20只Wistar大鼠，由广西大学动物科学技术学院提供，雌雄不限，月龄3～6(3.8±1.5)个月，体质量200～250(220±8)g。所有大鼠均养殖在清洁笼子里，室温(25.5±3.8)℃，相对湿度40%～45%，每天光照12 h，喂饮纯净水。经过1周饲养时间后，随机分为正常组和脑缺血组，其中正常组10只，脑缺血组10只。本实验获得我院实验动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脑缺血模型的建立 采取四动脉结扎法，参照杜郭佳等[3]的方法，并作出适当改进，脑缺血组大鼠均用10%的水合氯醛进行腹腔麻醉，以俯卧体位固定在立体定向仪上，将头顶部毛发剃除并消毒后，使用高频电刀在第一颈椎横突翼的左右横突孔永久性阻断椎动脉血流，1 d后，使用动脉夹将大鼠两侧的颈总动脉夹闭，5 min后打开动脉夹，实验结束。实验后大鼠出现意识混乱、瞳孔散大、呼吸加快、无痛感以及瞳孔对光反射消失等，说明脑缺血大鼠模型建造成功，大鼠实验过程中死亡(2只)以及实验结束后造模不成功者弃用。

1.2.2 标本采集 将待测大鼠用乙醚麻醉后，断头处死，切取脑组织70 mg，加入10倍体积的离心缓冲液，手动匀桨10 min，用离心机以2 000 r/min的转速分离，取上层血浆电动匀浆后，用离心机以3 000 r/min的转速分离，取上层血浆放置-50 ℃冰柜中冻存。

1.2.3 免疫组化法检测FOXO3a蛋白、Bax蛋白及Bcl-2蛋白 加入二甲苯和乙醇进行脱蜡处理，加入枸橼酸缓冲液进行切片抗原热修复，0.3% H2O2杀死过氧化物酶的活性，磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液清洗3～5次，待切片干燥加入稀释一定比例的一抗，在37 ℃的环境中培养1～2 h，之后再次使用PBS缓冲液清洗3～5次，使用DAB显色试剂盒显色3～5 min。通过比色达到检测FOXO3a蛋白、Bax蛋白及Bcl-2蛋白的目的。

1.2.4 双盲法测定神经功能评分 采用双盲法对大鼠手术后1 d、2 d、3 d进行转角实验。把大鼠放在30°的夹角里，观察大鼠往哪个方向转移，记录其转向，向左或是向右，每次实验重复10次，每次实验间隔大于15 s。评定神经功能评分，神经功能评分=右转次数/总次数×100%。

1.2.5 Western Blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3细胞自噬功能的改变 将冻存标本通过SDS-PAGE凝胶进行电泳，将适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液加入，静置15 min；在100 V的环境中电泳10 min，电泳结束后，将电转膜放置封闭在37 ℃环境中的摇床上，然后加入10%的牛奶，持续1.5 h；加入一抗，加入TBST稀释按(1∶1 000)稀释一抗，在4 ℃的环境下，经过孵育后过夜保存；第2天用TBST缓冲液清洗，在室温中与二抗结合，孵育1 h。再次用TBST缓冲液清洗，最后将其浸泡在底物溶液中进行显色，采用BCA蛋白定量试剂盒，分析灰度值，目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值=目的蛋白相对表达量，达到检测细胞自噬的目的。

1.2.6 倒置荧光显微镜下观察细胞自噬 用5%水合氯醛溶液将大鼠麻醉，固定，注入4%多聚甲醛PBS缓冲液150 mL，断头取脑，将脑组织存于4%多聚甲醛固定液中，包埋、切片、脱蜡，进行荧光染色。用倒置荧光显微镜下观察细胞自噬现象的产生，细胞内出现大量自噬荧光颗粒，这些现象提示可能有自噬发生。

2 结 果

2.1 正常组和脑缺血组大鼠FOXO3a蛋白表达比较 脑缺血组大鼠FOXO3a蛋白表达明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图1。

表1 两组大鼠FOXO3a蛋白表达比较(±s)

图1 FOXO3a蛋白免疫组化图(×100)

2.2 正常组和脑缺血组促细胞凋亡Bax蛋白及Bcl-2蛋白水平 脑缺血组大鼠Bax蛋白表达水平高于正常组Bax蛋白表达水平(P<0.05)；脑缺血组大鼠Bcl-2蛋白表达水平明显低于正常组Bcl-2蛋白表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图2。

表2 两组大鼠Bax蛋白及Bcl-2蛋白比较(±s) 单位：pg/mL

图2 Bax蛋白及Bcl-2蛋白免疫组化图(×100)(A为正常组Bax；B为脑缺血组Bax；C为正常组Bcl-2；D为脑缺血组Bcl-2)

2.3 正常组和脑缺血组神经功能评分比较 脑缺血组神经功能评分高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组大鼠神经功能评分比较(±s) 单位： 分

2.4 正常组和脑缺血组细胞自噬相关蛋白情况比较 脑缺血组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3及细胞自噬率高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图3。脑缺血组大量荧光颗粒显著多于正常组。在倒置荧光显微镜下观察到细胞内出现大量自噬荧光颗粒，这些现象提示可能有自噬发生。详见图4。

表4 两组大鼠细胞自噬相关蛋白比较(±s)

图3 Beclin-1、LC3细胞自噬率电泳图

图4 倒置荧光显微镜下细胞自噬观察(×400)

3 讨 论

脑卒中属于神经科疾病，临床病死率高达40%～50%。脑血管病变是其最为主要的发病原因，高血压、高血糖、高血脂等都与脑缺血有密切关系[4]。脑卒中病人大多是在安静状态下突发起病，突然发生的局灶性神经功能缺失症候群，损伤的症状符合血管分布区特点，幸存病人中大多留有不同程度的后遗症[5]，如运动型障碍、认知型障碍、言语型障碍等后遗症，这些都极大程度地危害病人身心健康，对病人生活及生存质量均造成巨大威胁[6]。

FOXO3a蛋白可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、增强抗氧化应激能力，调控细胞内环境的稳定，在细胞衰老的过程中发挥着至关重要的作用[7]。癌症中常见FOXO3a基因下调，肿瘤发生会造成FOXO3a在机体内的异常表达，有着密切关联，所以FOXO3被称为肿瘤抑制器。脑缺血会造成FOXO3a蛋白表达异常，从而导致细胞凋亡[8]。Bcl-2是重要的癌症基因，对细胞凋亡具有抑制作用，可以抑制多种细胞毒作用造成的细胞凋亡。细胞凋亡需要信号传导，存在一个共同的通路途径，这一途径主要是依靠Bcl-2控制[9]。DNA损伤之后需要依靠p53蛋白分子起传导或媒介作用，而Bcl-2抑制p53媒介凋零死亡，但是不能使p53媒介停止生长。Bax蛋白属于兔抗人单克隆体，是Bcl-2家族里促细胞凋亡基因。Bax蛋白会在线粒体膜上形成同源二聚体，使细胞内钙含量过高，诱导各种酶的激活，促使细胞凋亡。Bcl-2与Bax是相互对立的一对基因，高水平的Bcl-2可以使细胞对凋亡的抵抗力增强[10]。本研究发现，脑缺血大鼠体内Bcl-2与Bax水平均存在异常表达，对机体内细胞的生存环境造成严重影响，从而致使细胞发生自噬反应。

神经系统是人体内对生理功能调节的主要系统[11]，由神经组织组成，分为中枢神经及周围神经系统，包括脑和脊髓、脑神经和脊神经。人体内的结构和功能相当错综复杂，各个器官的生理过程都不是独立完成的，是在神经系统的调配控制下，相互联系、影响及配合中完成的[12]。在神经系统的调配下，人体才是一个完整统一的有机体。脑缺血病人最初神经功能受损程度会持续升高，待达到顶峰后会有明显的好转，但最终脑缺血会对病人神经系统造成巨大影响及损坏。杨靖等[13]在研究中表明，大鼠脑缺血会对大鼠神经系统造成严重损伤，与本研究结果一致，但其研究中脑缺血大鼠神经功能评分为(78.2±3.6)分，低于本研究中脑缺血大鼠神经功能评分，可能与研究所选取大鼠种类有关，本研究所选取大鼠为Wistar大鼠，Wistar大鼠是动物实验大鼠类最为常用及生物医学研究中使用历史最长的品种，广泛应用于生物医学各领域的实验。

细胞自噬是形成双层膜的自噬泡，将细胞质内的物质包裹起来，然后通过溶酶体融合并消化掉的过程。细胞自噬只是细胞在高胁迫的环境中细胞自行采取的一种应急机制，目的是在为自身提供营养或者降解掉错误折叠蛋白等，细胞的自噬并不一定会引起细胞死亡。中性粒细胞与细胞的吞噬和消化功能有关[14]。细胞自噬在中枢神经系统中具有重要的参与意义，主要发挥维持神经元功能作用。LC3是酵母自噬相关基因8，主要存在于哺乳动物中，是自噬体膜特异性重要组成部分。Beclin-1是哺乳动物酵母自噬相关基因6，在自噬体形成过程中发挥着重要作用，具有自噬激活象征。脑缺血-缺氧会引起LC3重新分布。

本研究显示，脑缺血组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3自噬率较高。在倒置荧光显微镜下观察到细胞内出现大量自噬荧光颗粒，这些现象说明可能有自噬发生。此与田雨等[15]研究结果保持一致。

综上所述，FOXO3a蛋白在脑缺血损伤中高表达，Bax蛋白在脑缺血损伤中高表达，Bcl-2蛋白在脑缺血损伤中低表达，脑缺血会对神经功能造成损伤，并提高细胞自噬率。FOXO3a蛋白、Bax蛋白、Bcl-2蛋白对脑缺血病人的治疗及预后有重要意义。