宏基因组第二代测序技术在神经外科颅内感染病原学诊断中的应用初探

徐跃峤 齐猛 尚峰 杨昆 洪韬 曲鑫 王宁

神经外科手术后并发颅内感染可使患者病情加重，治疗十分棘手，病死率高达15%～30%［1］，早期诊断、明确病原菌、合理应用抗生素，对改善患者预后具有重要意义。然而，目前针对脑脊液病原菌的检查方法，如细菌涂片和细菌培养不仅阳性检出率低且时间较长，许多患者由于无法获得明确的病原学诊断而被迫接受经验性大剂量、“广覆盖”抗生素治疗，导致抗生素过度应用，给患者造成严重的经济负担甚至医原性损害。除此之外，还有一些疑似颅内感染的患者，可出现脑脊液白细胞计数增加、葡萄糖下降等异常变化，如何及时与蛛网膜下腔出血、神经外科手术后脑脊液改变或无菌性脑膜炎相鉴别，长期以来一直是困扰神经外科医师的难题。目前，基于宏基因组的第二代测序技术（mNGS）已成功用于肿瘤基因检测、无创性产前诊断等领域，在感染性疾病诊治中的应用也日益受到重视，据文献报道，感染性心内膜炎的mNGS阳性检出率高于血培养和微生物病原学检测［2］。因此推测，针对脑脊液细菌培养周期长和阳性检出率低的缺陷，mNGS技术可能具有补充作用，但迄今尚无这方面的文献报道。首都医科大学宣武医院神经外科自2019年初开始尝试将mNGS技术应用于神经外科手术后并发颅内感染的早期诊断，初步探讨其临床应用价值。

资料与方法

一、临床资料

1．诊断标准颅内感染的诊断参照《中国神经外科重症患者感染诊治专家共识（2017）》［3］标准，符合以下4项者临床确诊颅内感染：（1）临床表现，意识及精神状态改变，颅内压增高症状与体征，脑膜刺激征阳性，同时伴颅内炎症反应导致的局灶性症状，全身感染症状表现为体温异常（＞38℃或＜36℃）、白细胞计数增加、心率和呼吸增快等。（2）影像学表现，头部CT和（或）MRI可见脑组织炎症性改变。（3）血清学检测，白细胞计数＞10×109/L或中性粒细胞比例＞0．80。（4）腰椎穿刺脑脊液检查，颅内压＞200 mm H2O（1 mm H2O=9．81×10-3kPa）；急性期外观浑浊、黄色或典型脓性，慢性期在炎症局限性包裹的情况下可清亮透明；白细胞计数＞（100～1000）×106/L、多核细胞比例＞0．70。对于症状与体征不典型的病例，入组满3周时由3位神经外科专家对其临床资料进行回顾分析，根据病情进展和实验室检查结果综合判断并做出诊断。

2．纳入与排除标准（1）临床疑似颅内感染：体温＞38℃且持续时间＞48 h；颈项强直；腰椎穿刺脑脊液白细胞计数增加（＞100×106/L）、葡萄糖降低（＜2．60 mmol/L）。（2）年龄≥18岁。（3）既往有神经外科手术、腰椎穿刺或脑室引流等有创性治疗史。（4）临床确诊颅内感染或近6个月内有明确中枢神经系统感染史患者均非本研究观察对象。（5）本研究经首都医科大学宣武医院道德伦理委员会审核批准［审批号：临研审（2017）072］。（6）所有患者及其家属对检测项目知情并签署知情同意书。

3．一般资料前瞻性纳入2019年1-10月在我院神经外科住院治疗且拟诊术后颅内感染患者共15例，男性9例，女性6例；年龄33～80岁，平均（54．21±14．92）岁。原发病分别为动脉瘤性蛛网膜下腔出血（9例）、颅脑创伤后脑积水（1例）、硬脊膜外脓肿合并脑脊液漏（1例）、静脉窦血栓形成合并脑出血（1例）、脑室出血（1例）、听神经瘤术后（1例）和面肌痉挛减压术后（1例）。

二、研究方法

1．脑脊液检测（1）颅内感染常规检测：腰椎穿刺抽取脑脊液10 ml，分别行常规、生化、细菌涂片和细菌培养。其中，细菌培养需脑脊液标本4 ml，在无菌操作下注入需氧血培养瓶中，常温下2 h内送检。（2）基因检测：腰椎穿刺抽取脑脊液1．50 ml，置于-20℃无菌离心管保存，24 h内送检（干冰运输），由迪飞医学科技（南京）有限公司进行脑脊液mNGS测序。取脑脊液1 ml，采用混悬液提取基因组DNA，经DNA质检后进入建库流程，文库质检后采用Illumina Nextseq 550Dx平台进行测序。下机数据剔除人源序列，将非人源序列与病原微生物数据库比对，计算序列数和相对丰度。根据生物信息分析列表，结合大样本分析获得黑名单和白名单，A针对结核分枝杆菌、诺卡菌和嗜肺军团菌，检出1条特异性序列即为阳性；B针对其他细菌、真菌、病毒和寄生虫，检出3条非重复特异性序列即为阳性；C的物种检出序列数小于其在阴性对照中的10倍，则剔除该物种。按照上述阈值筛选病原微生物列表和疑似背景微生物列表，并辅以序列数和结果注释。mNGS序列数＞100为基因检测呈阳性。

2．血清学检测采集初次拟诊颅内感染患者的外周静脉血共10 ml，分别行血常规、生化、C-反应蛋白（CRP，1～8 mg/L）和降钙素原（PCT，＜0．05 ng/ml）测定。

3．治疗方法根据患者病情严重程度采取经验性抗生素治疗，首选万古霉素1 g/次（2次/d）和美罗培南2 g/次（3次/d）静脉滴注，治疗3 d后症状明显减轻或消失，连续检测脑脊液白细胞计数持续减少、葡萄糖恢复至正常值范围，脑脊液细菌涂片和细菌培养均呈阴性者，排除颅内感染，停用抗生素。对于脑脊液细菌涂片、细菌培养和mNGS测序均呈阴性者，若临床症状持续或加重，脑脊液白细胞计数不降或持续增加、葡萄糖水平不升或持续降低，仍支持颅内感染诊断，继续原定抗感染方案或联合其他抗生素治疗；而脑脊液细菌涂片和细菌培养均呈阳性患者，需结合病情严重程度，根据病原学检查结果合理选择抗生素治疗。

4．统计分析方法采用SPSS 22．0统计软件进行数据处理与分析。计数资料以相对数构成比（%）或率（%）表示，采用χ2检验；呈正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用两独立样本的t检验。以P≤0．05为差异具有统计学意义。

表1脑脊液mNGS测序诊断术后颅内感染的灵敏度和特异度Table 1. Sensitivity and specificity of CSF mNGS sequencing in the diagnosis of intracranial infection after neurosurgery

结 果

15例患者最终确诊颅内感染8例，其中4例脑脊液mNGS测序呈阳性（序列数分别为212、329、1601和5371），病原菌检测分别包括鲍曼不动杆菌（2例）、皮特不动杆菌（1例）和产气肠杆菌（1例），与脑脊液细菌培养结果一致，同时伴脑脊液白细胞计数增加［分别为（1481、9722、3481、131）×106/L］和葡萄糖降低（分别为2．53、0．02、0．91、1．60 mmol/L）。其余4例经为期2周随访，临床确诊为颅内感染，但脑脊液细菌培养和mNGS测序均呈阴性，其中1例发热次日脑脊液细菌涂片呈阳性（阳性球菌），但细菌培养和mNGS测序呈阴性；3例临床诊断明确，但脑脊液细菌涂片、细菌培养和mNGS测序均呈阴性，考虑为采集脑脊液标本时已接受抗生素经验性治疗并临床症状好转，与标本中细菌量不足有关。临床诊断为无菌性脑膜炎7例，其中3例脑脊液mNGS测序测得背景细菌基因序列，但序列数均＜100；1例蛛网膜下腔出血伴急性脑积水行脑室外引流术患者，引流8 d后拔除引流管，管头细菌培养为表皮葡萄球菌，但mGNS测序呈阴性，随访2周，无感染症状，确诊管头细菌培养阳性为表皮葡萄球菌污染所致。脑脊液mNGS测序诊断术后颅内感染灵敏度为4/8、特异度为7/7，准确率为11/15（表1）。8例临床确诊术后颅内感染患者的临床资料参见表2。

典型病例

患者女性，39岁。因动脉瘤性蛛网膜下腔出血术后2个月，左侧颅骨缺损伴脑积水、右侧硬膜下积液需手术治疗，于2019年1月3日入院，并于1月15日行腰大池引流术，1月18日再次行颅骨修补术。引流术后7天出现发热，体温最高达39．2℃，呈弛张热，伴颈项强直，拟诊术后颅内感染。遂于1月22日行腰椎穿刺抽取脑脊液10 ml，外观浑浊，细胞总数11 322×106/L、白细胞计数9722×106/L、分叶核中性粒细胞比例0．86，葡萄糖低至0．02 mmol/L；细菌涂片可见革兰阴性球菌和杆菌生长；mNGS测序提示病原菌为鲍曼不动杆菌，序列数为1601（图1）；多次细菌培养均证实为鲍曼不动杆菌。血清学检查：白细胞计数15．34×109/L、中性粒细胞比例0．887，C-反应蛋白27．20 mg/L。临床确诊为术后颅内感染，病原菌为鲍曼不动杆菌。遂予以美罗培南2 g/次（3次/d）静脉滴注，替加环素50 mg/次（2次/d）静脉滴注、5 mg脑室内注射，连续3周，以及多粘菌素B 50 mg/次（2次/d）静脉滴注、5 mg/次（2次/d）鞘内注射，连续治疗5天，颅内感染症状显著好转。由于存在脑积水，拟进一步行脑室-腹腔分流术。治疗3周后复查脑脊液细菌培养呈阴性，mNGS测序鲍曼不动杆菌序列数为8，结合脑脊液外观清亮、白细胞计数和葡萄糖均于正常值范围，考虑颅内感染治愈，于3月8日行脑室-腹腔分流术，术后未再发生颅内感染。

表2 8例临床确诊术后颅内感染患者的临床资料Table 2.Clinical data of 8 patients with intracranial infection after neurosurgery

讨 论

基于神经外科开颅手术对蛛网膜下腔和脑组织结构的影响，以及手术所用人工材料引起的异物反应，均可能是术后诱发无菌性脑膜炎的原因；临床主要表现为发热、头痛或颈项强直等，这些症状通常也是术后细菌性脑膜炎的表现，仅根据症状与体征难以对细菌性脑膜炎与无菌性脑膜炎进行早期鉴别，而二者治疗方案完全不同。因此，如何对术后细菌性脑膜炎与无菌性脑膜炎做出快速鉴别诊断，是神经外科最迫切的需求之一［4］，也是一直以来神经外科与临床微生物学研究的热点［5］。目前脑脊液常规、生化、细菌涂片和细菌培养均无法满足这一早期鉴别诊断的需求，已知的检测技术主要有基因芯片［6］、多模态检测［4］等，目前尚未广泛应用于临床。

本研究对脑脊液mNGS测序诊断术后颅内感染的价值进行初步探讨，其结果显示，脑脊液mNGS测序与脑脊液细菌培养符合率较好。本组15例患者中8例临床确诊为颅内感染，其中4例脑脊液mNGS测序和细菌培养均呈阳性，其余4例经随访也临床确诊为颅内感染，但脑脊液mNGS测序和细菌培养均呈阴性，考虑与留取标本时已应用抗生素经验性治疗，标本中细菌量不足有关。提示对于临床疑似颅内感染的患者应尽量在抗生素经验性治疗之前采集脑脊液标本，或感染早期脑脊液存在细菌量相对较多时留取标本。鲍曼不动杆菌感染患者治愈后，其脑脊液mNGS测序仍能测出少量序列数，考虑为细菌DNA片段残留，但数量极少。本组有1例腰大池引流术+颅骨修补术后鲍曼不动杆菌感染患者，抗生素治疗3周后复查mNGS测序，鲍曼不动杆菌序列数为8，结合复查细菌培养阴性，以及脑脊液外观、常规和生化指标均正常，考虑颅内感染治愈，进一步行脑室-腹腔分流术，术后未再发生颅内感染，证实颅内感染治愈，提示mNGS测序有助于判断颅内感染后脑室-腹腔分流术的时机。

图1脑脊液mNGS测序检测鲍曼不动杆菌特异性序列数为1601，基因组覆盖度为23．02%Figure 1 CSF mNGS showed the specific sequence number of Acinetobacter baumannii was 1601,and the genome coverage was 23．02%．

神经外科术后易导致颅内感染的致病菌主要包括表皮葡萄球菌、不动杆菌或肺炎克雷伯杆菌等，其中尤以鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌等引起的严重化脓性脑室炎最为严重且治疗困难［7-8］。本组患者脑脊液mNGS测序和细菌培养呈阳性的致病菌分别为不动杆菌3例（鲍曼不动杆菌2例和皮特不动杆菌1例）、产气肠杆菌1例，均为革兰阴性杆菌，可能与此类细菌对抗生素治疗不敏感，较易获得阳性结果有关。而阳性菌感染患者，如果早期合理应用抗生素，可迅速控制病情并使细菌量显著减少，导致脑脊液细菌培养和mNGS测序均呈阴性。

基因检测和测序技术目前是多个感染相关学科的研究热点，但用于神经外科手术后颅内感染的诊断，目前国内尚未见诸报道。理论上，无论细菌存活或死亡均可检测到DNA片段，故脑脊液mNGS阳性率理论上应该高于细菌培养阳性率，但就本组患者而言，由于临床检验条件的限制，脑脊液基因检测需外送标本，不能在短时间内进行mNGS测序，这可能是mNGS测序阳性率较低的原因。基因检测作为一项新的技术，在发现罕见病原体如病毒或罕见细菌、真菌方面具有不可替代的作用［9-10］，但是该技术检测成本较高、检测时间较长（24～48小时），对于发病急骤、病情进展迅速的中枢神经系统感染患者而言，影响其时效性［11］，因此，该项技术用于神经外科手术后颅内感染的诊治尚待进一步摸索送检标本方案以提高检测速度和阳性率，方能更好地服务于临床，优化治疗方案，改善患者预后。

利益冲突无