加格略(重楼)蒸制前后HPLC 指纹图谱对比研究*

张 敏，李 玮，黄颖雪，何兰兰，王 令，郑继广，王小波

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

重楼为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花ParispolyphyllaSmith ar.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎。具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，主要用于咽喉肿痛、跌打伤痛、毒蛇咬伤、惊风抽搐等症[1]。苗医学记载加格略又名重楼、七叶一枝花、灯台七、独角莲，具有补虚的作用[2]。现代研究表明，加格略主要化学成分为甾体皂苷、甾醇、黄酮类等[3-6]。其主要应用于抗肿瘤、止痛镇静、抑菌消炎、抗病毒、心脑血管、免疫调节、胃肠疾病等的治疗[7-9]。

《贵州苗药·兴仁卷》记载，采用加格略蒸制品治疗胃溃疡，临床上尚未见报道。本课题组前期开展的加格略蒸制前后抗胃溃疡药效研究发现，蒸制前后抗胃溃疡作用具有一定的差异，有关其存在差异的具体原因尚不清楚，因此，本研究在前期研究的基础上，以蒸制前后指纹图谱对比研究，从整体上判断蒸制前后指纹图谱是否具有差异，以阐明加格略蒸制前后抗胃溃疡药效差异的原因。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪(型号：LC-16，岛津仪器(苏州)有限公司)；超声波清洗机(型号：HS10260D，天津恒奥科技发展有限公司)；万分之一电子分析天平(型号：ME204E，上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；十万分之一电子分析天平(型号：AUW220D，苏州岛津仪器有限公司)；高速万能粉碎机(型号：LDP-150，浙江永康市红太阳机电有限公司)；真空干燥箱(型号：DZ-2BC，天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

重楼皂苷Ⅰ(批号GDZZ-0605)、重楼皂苷Ⅶ(批号GDZZ-0609)、重楼皂苷Ⅵ(批号GDZZ-0608)、重楼皂苷Ⅱ(批号GDZZ-0606)，均来自贵州迪大生物科技有限责任公司。甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，含量≥99.9%，批号20180820)；乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，含量≥99.9%，批号20180223)；提取所用甲醇为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司，质量分数≥99.5%，批号20171115)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司授权贵阳娃哈哈昌盛饮料有限公司制造，批号20180829)；其余试剂均为分析纯。

加格略药材购自安顺市宝林科技中药饮片有限公司，经贵州中医药大学药学院魏升华教授鉴定为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz的新鲜根茎。具体来源见表1。

表1 10批加格略药材来源表

2 方法与结果

2.1 样品的制备

加格略生品的制备：取加格略药材，洗净，于60 ℃烘箱烘干。

加格略蒸品的制备：取加格略鲜药材，洗净，放置蒸锅内蒸制透心，取出，放凉，于60 ℃烘箱烘干。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取加格略皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ对照品适量，于容量瓶中，加入甲醇，制成含加格略皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ浓度分别为0.5 mg·mL-1的混合对照品溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.3 供试品溶液的制备

取过3号筛的加格略粉末约0.5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密称定，加入甲醇10 mL，称重，超声提取30 min，冷却至室温，用甲醇补重，过滤，即得。

2.4 色谱条件

色谱柱：InerSustain C18(5 μm，4.6×250 nm)，流动相：乙腈(B)-水(A)，梯度洗脱程序见表2；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量10 μL。

表2 流动相洗脱程序

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

取同一供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次。通过指纹图谱相似度评价软件，进行色谱峰匹配，所得图谱之间相似度在0.999～1.000之间，均大于0.900，其共有色谱峰相对保留时间RSD值均小于3%，表明该仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、18 h、24 h进行测定。通过指纹图谱相似度评价软件，进行色谱峰匹配，计算图谱相似度在0.996～1.000之间，均大于0.900，其共有色谱峰相对保留时间RSD值均小于3%，表明该样品溶液在24 h内较稳定。

2.5.3 重复性试验

取同一批次药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下的色谱条件进行测定，计算相似度在0.996～1.000之间，其共有色谱峰相对保留时间RSD值均小于3%，结果表明该实验方法重复性良好。

2.6 样品HPLC指纹图谱的建立及技术参数

2.6.1 生品指纹图谱共有模式的建立及共有色谱峰的标定

取10批加格略生品样品粉末适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，记录谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算相似度并建立10批加格略生品指纹图谱共有模式。

对不同的供试品色谱图的检测结果进行比较，共标定了11个共有指纹图谱色谱峰。以重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合对照品对色谱峰进行定性分析，标示出特征峰，确认了7号峰为加格略皂苷Ⅵ、8号峰为加格略皂苷Ⅶ、9号峰为加格略皂苷Ⅱ、10号峰为加格略皂苷Ⅰ。因重楼皂苷Ⅶ为加格略主要有效成分之一，与其他色谱峰相比其分离度和峰型较好，理论塔板数较高，故将其设定为内参物，其色谱峰标记为S。结果见表3、图1。

表3 10批加格略生品相似度

7重楼皂苷Ⅵ 8重楼皂苷Ⅶ 9重楼皂苷Ⅱ 10重楼皂苷Ⅰ

2.6.2 蒸制加格略指纹图谱

取蒸制品加格略样品粉末，按“2.3”项最佳提取工艺方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，记录谱图。见图2。

图2 蒸制加格略指纹图谱

2.6.3 蒸制前后指纹图谱对比

通过蒸制品与生品共有模式及同一批次蒸制品与生品相比较，从整体上判断蒸制前后指纹图谱的差异，得出加格略蒸制品与生品色谱峰数量及峰高具有一定的差异，结果见图3。

S1蒸制品 S2生品

3 讨论

通过对提取方法、提取溶剂、溶剂质量分数、料液比、提取时间等进行考察，最终优化的最佳提取工艺为：取0.5 g粉末，加入质量分数为100%甲醇10 mL，超声提取30 min。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统(2012版(国家药典委员会))对10个批次的加格略药材的色谱图进行比较研究，发现不同批次的加格略药材整体色谱峰峰型相似，其相似度在0.812～0.951之间，说明不同产地加格略药材的化学组成一致性较好。可用于加格略药材的质量评价。

以生品共有模式与蒸制品及同一批次生品与蒸制品相比较，从整体上得出蒸制品和生品指纹图谱间具有明显的差异，因此初步判断加格略蒸制前后化学成分及含量发生了一定的变化。本研究为前期加格略蒸制前后抗胃溃疡药效差异提供了一定的依据。该试验方法简单易行，重复性较好，可为加格略药材质量分析和后期抗胃溃疡药效物质基础进一步研究奠定一定的基础。