雪峰乌骨鸡HSP70基因多态性与精液品质关联分析

喻宗岗，蒋 隽，姚亚铃，郭 英，李 闯，燕海峰，*

(1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131； 2.湖南农业大学 动物科学技术学院，湖南 长沙 410128； 3.湖南洪江嵩云禽业有限公司，湖南 洪江 418200)

热休克蛋白70基因(heat shock protein 70，HSP70)是一种高度保守、没有内含子的基因，在细胞保护、抗氧化和免疫中被广泛研究。在精液品质方面，HSP70基因的研究主要集中于人、小鼠和反刍动物，而在鸡中的研究较少，其在鸡精液冷冻保存方面的研究更是鲜有报道。武鸿斌等[2]在弱精、少精患者中研究发现，HSP70基因与精子密度、精子活力显著相关[2]；万卫斌等[3]报道指出，HSP70基因可以抑制解脲脲原体细胞凋亡，从而改善男性不育。有多篇研究发现，HSP70基因可以作为鼠精液品质的遗传标记[4-7]。在牛的研究中发现，HSP70基因不仅可以作为精液品质的评定指标[8-9]，其表达还与精液品质相关[9-12]。在鸡的研究中，HSP70基因不仅可以作为鸡繁殖性状的候选基因[13]；而且其表达与冻后精子复活力相关[14]。因此，HSP70基因可以作为精液品质的候选基因。

本文以HSP70基因作为鸡冻精品质的候选基因，利用测序筛选多态性位点，并与雪峰乌骨鸡精液品质及冻精品质进行关联分析，以期获得与鸡精液抗冻性相关分子标记，为雪峰乌骨鸡的精液冷冻保存和保种提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

110只27周龄白羽雪峰乌骨种公鸡购自嵩云禽业有限公司，饲养在相同条件下，自由采食，每日光照时间16 h。EDTA真空抗凝采血管翅静脉采血，采2支，每支约1～2 mL，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 试验材料

动物基因组DNA提取试剂盒(TSP201-200)、I-5TM2X Hi-Fi PCR Master Mix(TP001)、琼脂糖(TSJ001)、DL 2000 DNA Marker(TSJ011-100)、K2EDTA-2ML真空采血管购自擎科新业生物科技有限公司。

1.2 精液采集与处理

1.2.1 精液采集与稀释

按照水利部、财政部、国土资源部和中国气象局的有关文件要求，省水利厅会同省财政厅、省国土资源厅、省气象局成立了项目建设领导小组，并成立省山洪灾害预警系统建设项目办公室（以下简称省项目办）作为项目法人，承担项目的建设管理工作；各设区市、县成立相应的项目建设管理机构，省市水文部门作为同级项目办成员参与项目建设管理，以支撑项目中暴雨洪水监测系统的建设；气象部门成立相应项目建设机构负责气象部门实施内容的建设。

使用背腹联合按摩法采精，参比EP管刻度记录采精量，分别吸取0.2、0.1 mL精液于含有预热LR液和密度测定液的EP管中，置于冷藏箱中待测。

1.2.2 鲜精活力检测与抗冻液添加

将带回实验室的精液置于4 ℃冰箱中平衡30 min，期间吸取10 μL于32 ℃恒温视频显微镜下检测鲜精活力。平衡30 min后，每管稀释精液按1∶1添加0.4 mL冷藏于4 ℃的LRD(DMA浓度为12%)，充分混匀后于4 ℃冰箱平衡10 min。

1.2.3 细管制作、冷冻与解冻

冻精制作在4 ℃电子冰箱中完成，细管中部留约1 cm的空气柱，以防冷冻过程中爆裂；灌装后的细管用记号笔，每5只公鸡的细管为1组，按照公鸡编号由小到大编号。制作完后，将细管铺在细管导板上用胶带固定，并标记相应的组号。所有组完成后将细管精液在自制的细管熏蒸架3 cm处，置于液氮中冷冻7 min。精液冷冻和解冻方法参见文献[15]。

1.2.4 精液品质检测

取10 μL精液在32 ℃恒温视频显微镜下观察[15]，测定精子活力，标准参考中国百科大辞典。通过建立吸光值-精子密度曲线法计算密度。采用分光光度计测量精液吸光值，设置12个精液稀释梯度，每个梯度设置3个生物学重复和3个技术重复。在合适的稀释倍数下采用血细胞计数法测算精子密度，计数变异系数控制在10%以内。根据稀释比例关系推算其他各稀释倍数下的精子密度，最后建立吸光值-精液密度回归方程。

1.3 HSP70基因SNP筛选与分型

用试剂盒提取基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。使用NCBI数据库中HSP70基因序列(GenBank No. J02579.1)，primer 5.0 软件设计PCR引物。引物序列为HSP70-F：TTGTGATTGGCTGAGGGGAGT，HSP70-R：GCACTTGGCATTTCTCATCTTTCAC；退火温度56.5 ℃，产物2 647 bp。反应体系：I-5TM2X Hi-Fi PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，双蒸水9.5 μL。反应程序：98 ℃预变性120 s；98 ℃变性10 s，57 ℃退火10 s，70 ℃延伸30 s，共35个循环；70 ℃终延伸300 s。将经电泳检测合格的PCR产物送湖南长沙擎科新业生物科技有限公司测序。使用Contig程序对每个个体读取碱基后的序列拼接、组装，使用DNAMan软件对拼接序列进行比对筛选出各个SNPs，并根据SNPs位点峰图，完成分型。

1.4 数据统计分析

在Excel中整理数据，计算各突变位点的基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数(number of effective alleles，Ne)、遗传纯合度(homozygosity，Ho)、遗传杂合度(heterozygosity，He)和多态信息含量(polymorphic information content，PIC)。使用SPSS 19.0软件统计分析，群体基因遗传平衡的使用卡方适合性检验，采用单因素方差分析检验各基因型下精液品质指标差异显著性，差异显著时进行Duncan’s多重比较，结果以平均数±标准误表示。统计分析模型如下：

y=μ+G+ε。

(1)

式(1)中，y为观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，ε为随机误差。

2 结果与分析

2.1 吸光度与精子密度

计数板法测定的精子密度与密度仪测定的吸光值见表1。建立吸光值-精子密度回归方程为y=0.063 2x3-0.010 5x2+0.905 9x+0.001 8。式中，y代表精子密度(108·mL-1)，x代表吸光值。

表1 精子密度与吸光值测定结果

2.2 HSP70基因SNPs筛选

挑选高、中、低3种精液品质的雪峰乌骨鸡基因组DNA制作3个混合池，对3个混合池的HSP70基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳电泳检测，得到均一明亮的条带，说明DNA质量较好，满足后续测序要求。

2.3 HSP70基因突变位点基因分型

对每个样本的HSP70基因进行PCR扩增及测序，确定各样本的基因型，基因型如图1。经测序比对后发现在HSP70基因436 bp处有1处共有突变G>A，该处位点存在GG、AA和AG这3种基因型。

图1 HSP70基因SNPs测序峰图分析Fig.1 SNPs sequencing peak map analysis of HSP70 Gene

2.4 雪峰乌骨鸡HSP70基因多态位点群体遗传

对雪峰乌骨鸡群体HSP70基因突变位点进行遗传多样性分析(表2)，该基因的SNP位点可将个体分为GG、AG、AA这3种基因型，该突变位点的PIC为0.371 4(0.25

表2 HSP70基因型和等位基因频率卡方分析及突变位点多样性分析

2.5 雪峰乌骨鸡HSP70基因多态位点与精液品质的关联

对雪峰乌骨鸡基因分型后各组群的精液指标与HSP70基因多态性关联分析见表3。如表所示，GG型的采精量、精子密度均极显著(P<0.01)高于AG和AA型，精子的冻后活力极显著(P<0.01)高于AA型，显著(P<0.05)高于AG型；AG型的采精量和精子密度极显著(P<0.01)高于AA型，冻后活力差异不显著(P>0.05)。

表3 基因突变位点基因型与精液品质关联分析

3 讨论

3.1 大样本量公鸡精子密度测定的影响因素

精子密度显著影响受精率[16]和精液冷冻保存效果，合适的精子密度可以最大限度发挥优良种畜的繁殖潜能，因此，准确计算精子密度十分必要。计算精子密度的常规方法是血细胞计数法，该方法步骤繁琐、耗时、低效，不适宜大量样本精液密度的测定。本研究采用吸光值-精子密度回归曲线方程法，只需使用分光光度计测量精液的吸光度，代入方程即可快速计算精子密度，极大地提高了测定效率。吸光值在0.5～1.0范围内，计数值变异系数控制在8%以下时，计数结果较为准确。

3.2 基因分型技术分析

目前常使用的基因分型方法有酶切法、高分辨率溶解曲线法(high-resolution melting，HRM)和测序法。酶切法酶切条件不好掌握且操作繁琐，受人为因素影响大，可能会出现假阴性结果。HRM法要求扩增序列短，且对荧光定量PCR仪的HRM性能有很高要求，对大于100 bp的序列特异性不够。随着测序技术的发展，测序成本的降低给科学研究带来了极大的便捷。本研究采用测序分型，该方法较酶切法省去了酶切位点寻找、凝胶电泳等繁复的步骤，更加简捷，减少了试验系统误差，提高了结果的准确性。同时，与HRM法相比，该方法可以对更长的序列进行分析，特异性更好，适用范围更广。

3.3 精液冻存的影响因素

冷冻精液对于种质资源保存、群体规模扩大和生产性能提高有着重要的推动作用。已有研究通过筛选稀释液、稀释比例、抗冻液、冷冻速率与解冻速率、添加抗氧化剂等措施来提高冻精品质。精液是否抗冻是优质冻精的基础。本课题组通过前期的试验发现，鸡个体与品种间精液存在抗冻性差异，本文从基因变异的角度来解析抗冻性的这种差异。

3.4 HSP70基因多态性与冻精品质关联分析

HSP70基因编码的蛋白质是最保守最重要的蛋白，普遍存在于原核和真核细胞中，参与多种生理过程，发挥着调控细胞凋亡[17]、抗氧化[18]、参与肿瘤调节[19]等多种生物学功能。有研究表明，HSP70基因可以作为精液品质的候选基因，且该基因的表达可以抵御热应激[20-22]和运输应激[23-24]，也有研究报道发现鱼中该基因的表达可以抵御冷冻刺激[25]，在鸡冻精中的研究还未见报道。本研究发现，HSP70基因436 bp处存在突变G>A，突变位点与鸡冻精品质关联分析发现，该突变位点显著影响鸡精液冻后活力、采精量和精子密度，可以作为鸡冻精品质的分子标记。本试验结果与HSP70基因在山羊和牛的冻精研究中的结果相似[26-28]。宾石玉等[29]研究发现，鱼HSP70基因多态性与耐寒性状显著相关。有报道指出，HSP70蛋白通过参与精子膜蛋白折叠来抵御冷冻刺激，从而影响精子活力[30]，通过抑制线粒体释放细胞凋亡诱导因子发挥抗应激能力[31]，这为精液抗冻机制提供了有力证据。本文未研究HSP70基因的表达特性，精液抗冻性的分子机制是否与HSP70基因的表达有关还有待进一步验证。

致谢：本研究由湖南家禽安全生产工程技术研究中心和长沙市科技计划(kh1901146)共同资助。