油菜杂交种DNA高通量获取方法

2020-08-28俎峰李霞何晓莹赵凯琴陈苇束正齐董云松

湖北农业科学 2020年12期

俎峰李霞何晓莹赵凯琴陈苇束正齐董云松

摘要：通过油菜（Brassica napus）杂交种深孔板内发芽，简化碱裂解法提取DNA步骤，配合高通量研磨器Fast&Fluid Management SK300样品混匀仪的使用，提供了一整套快速高通量低成本获取油菜杂交种子叶DNA样品的集约化方案。该方法可以实现10 h完成万份DNA样品的提取，极大提高了DNA获取效率，有利于利用分子标记对杂交油菜种子进行纯度鉴定。

关键词：油菜（Brassica napus）;杂交种;DNA提取;分子标记;纯度鉴定

中图分类号：S565.4

文献标识码：A

文章编号：0439-8114（ 2020）12-0179-03

D01：10.1408 8/j .cnki.issn043 9- 8114.2020.12.040

開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

油菜（Brassica napus）是典型的异花授粉作物，杂种优势强。目前在中国大部分油菜种植区所种植的油菜品种为杂交种。油菜杂交品种在出售前需要进行严格的纯度鉴定。传统的杂交油菜纯度鉴定多采用异地田间种植[1]和蛋白质电泳检测[2]。田间种植鉴定所需周期长，成本高，且对鉴定人员的经验依赖度较高，鉴定结果不稳定，较难适应当年供种的生产需要[3]。蛋白质电泳检测多以同工酶和贮藏蛋白电泳条带为依据，这类标记多态性相对较低，且受到电泳技术影响，在杂交种纯度检测应用方面受到限制[4]。分子标记具有遗传信息丰富，检测不受季节、环境影响的优点，是目前最实用的遗传标记系统[5]。随着生物技术的不断发展，分子标记检测手段越来越多地被应用到油菜杂交种纯度鉴定中[6-7]。为此众多研究者针对DNA提取的方法、步骤及样品如何研磨进行了简化与优化研究[8-11]。但是，这些研究在实际应用于分子标记检测油菜杂交种纯度时缺乏系统性与整体性，DNA提取效率与通量还有待提升。

本研究在前人工作基础上，系统整合深孔板内发芽技术与简化碱裂解法提取DNA技术，并配合高通量研磨器Fast&Fluid Management样品混匀仪的使用，以期提供一整套快速高通量低成本获取油菜杂交种子叶DNA样品的集约化方案。

1 材料与方法

1.1 材料

油菜种子为云南省强优势杂交组合云油杂15号及其双亲材料IIXS08IA与10016C，由云南省农业科学院经济作物研究所油菜中心提供。

所用试剂为0.2%的琼脂糖凝胶、0.2 mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的Tris-HCI溶液。

仪器设备有0.4 cm瓷珠、Eppendorf连续分装器、Fast&Fluid Management SK300样品混匀仪、Ep-pendorf AC 22331 Hamburg（型号0034546）高速平板离心机。

1.2 方法

1.2.1 杂交种播种与发芽配制0.2%的琼脂糖凝胶冷却至室温。先利用连续分装器在96孔深孔板中每孔（规格2mL）加入0.20 mL 0.2%的凝胶，再每孔播人1粒油菜种子，保鲜膜密封深孔板，光照培养箱/室发芽3-7 d，每天光照16 h，黑暗8h。

1.2.2 DNA提取待子粒发芽，子叶展开（60°～180°），深孔板每孔内加入瓷珠1颗，再利用连续分装器加入0.25 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液。之后将深孔板置于95℃水浴锅内水浴3 min，取出后加盖乳胶封口膜，置于Fast&Fluid Management SK300样品混匀仪中进行样品研磨，时间设定为2 min。取出研磨好的深孔板，打开封口膜，利用连续分装器每孔加入0.75 mL 0.1 mol/L的Tris-HCI溶液。最后将深孔板（每次4板）精确称重后对称置于高速平板离心机，4 000 r/min离心2-5 min，轻轻取出。离心好的深孔板其上清液可直接用于后期PCR扩增，吸取上清液即为样品DNA，-20℃保存。

1.2.3 PCR扩增反应与垂直板电泳检测 PCR扩增体系：50 ng DNA，lxPCR缓冲液，2.0 mmol/L MgCl：，0.2 mmol/L dNTPs，0.5 UTaq酶，正向及反向SSR引物各12.5 ng，反应总体积为10 μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min;94℃变性30 s，60℃（-0.5℃/循环）退火30 s，72℃延伸45 s，9个循环;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环;4℃保存。

扩增产物于6%变性PACE凝胶上电泳th分离，采用0.5xTBE，80V电压。电泳完成后，银染法显带，用数码相机拍照保存图片。

2 结果与分析

2.1 杂交种深孔板中发芽

播种后2d，油菜种子在深孔板中发芽，3-7 d子叶展开60°-180°（图1]，即可用于DNA提取。在此期间，0.2 mL 0.2%的黏稠态琼脂糖凝胶可保护种子不沉人深孔板底部，为种子发芽提供足够的水分及为幼芽提供根部附着与支撑，同时深孔板孔内也有足够的空间供种子发芽，子叶伸展。保鲜膜密封深孔板可保护其中的水分不被蒸发，期间不再需要人为补充水分，降低管理与用工成本。

2.2 10 h完成万份DNA提取

Fast&Fluid Management SK300样品混匀仪一次可放人4块96孔深孔板，2 min完成研磨，th即可研磨上万份样品，极大地提高了样品研磨的通量。研磨过后95℃水浴锅水浴3 min，依据水浴锅的大小，105块深孔板（10 080份样品）可在1-2 h完成。Eppendorf AG 22331 Hamburg高速平板离心机每次可离心4块深孔板，离心2-5 min。按离心5 min计算，105块深孔板约3h即可完成。由此可见此种方法固定的操作时间短于6h，配合使用连续分装器添加相应试剂，10 h可以完成万份DNA提取。

2.3 杂交种DNA PCR扩增产物电泳

利用提取的DNA作为模板，PCR扩增后，电泳结果显示该方法提取的DNA可扩增出清晰的条带，96个样品中共计有7个父本纯合基因型单株（图2），由此计算出本试验使用的云油杂15号杂交种样品纯度为92.7%。

3 讨论

分子标记检测杂交种纯度需要确定单颗种子的基因型，而油菜种子较小，尚无法实现低成本高通量获取油菜单粒干种子DNA。因此单颗种子DNA的提取一般都包含以下2个步骤：第一步，种子发芽，获取单粒种子子叶或叶片样本;第二步，子叶或叶片DNA提取。虽然目前提取DNA的方法已经被研究者多方优化与简化[8，9]，但多局限于某一个技术环节的改良，如样品研磨[8]或方法改良[9]，均未能有效地整合上述DNA提取的两个步骤，无法避免人工单个子叶/植株取样分装进离心管这一费工费力费时的环节，亦无法实现种子发芽与DNA提取过程的无缝对接。本研究利用深孔板种子发芽后直接放人Fast&Fluid Management SK300样品混匀仪，减少发芽后再取样的过程，实现了发芽与DNA提取的无缝对接，缩减工序提高效率。同时本研究进一步简化了现有的碱裂解法提取DNA步骤，再配合Fast&Fluid Management SK300样品混匀仪的使用，有效地整合了DNA提取的两个步骤，提出了一整套集约化方案，实现10 h完成万份DNA样品的提取，极大提高了DNA获取效率，节约了人力和物力，能够显著降低分子标记检测杂交种纯度的成本与时间。

由于使用的是碱法提取DNA，DNA有效保存时间较短。在高通量获取到杂交种DNA后，需要及时进行PCR反应，高效快速配制上万份DNA材料的PCR反应体系是个不小的挑战。为此本研究团队发明了用于PCR反应体系批量配制的简易高通量移液器[12]。使用该移液器，可一次性完成整板（96孔）PCR反应体系DNA模板的添加，并免去了传统的移液器吸头的使用[12]。因此，本DNA提取方法配合用于PCR反应体系批量配制的简易高通量移液器的使用能极大提高分子标记检测油菜杂交种纯度的效率，缩减成本。

参考文献：

[1]朱国富，夏英萍.杂交油菜种子异地纯度鉴定技术探讨[J].安徽农学通报，2004，10（2）：32.

[2]王同华，曲亮，谢运河，等，醇溶蛋白电泳与田间种植鉴定油菜杂交种纯度的相关性研究[J].现代农业科技，2013（16）：17-18.

[3]农业部全国农作物种子质量监督检验测试中心.农作物种子检验员考核学习读本[M].北京：中国T商}H版社，2006.259-273.

[4]王中仁.植物等位酶分析[M].北京：科学H{版社，1996.69-73.

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[6]卢虹，徐爱遐.SSR分子标记技术在甘蓝型油菜杂交种陕油16纯度鉴定中的应用[J].种子，2016，35（6）：123-126.

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[11]严明理，刘忠松，官春云，等用于PCR分析的芥菜型油菜总DNA的快速提取[J].现代农业科技，2008（16）：172-173.