芥子及其炮制品配方颗粒的UPLC指纹图谱研究

何民友，王利伟，吴淑珍，李国卫，吴文平，孙冬梅

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室,广东 佛山 528244)

芥子为十字花科植物白芥SinapisalbaL. 或芥Brassicajuncea(L.)Czern. et Coss. 的干燥成熟种子。前者习称“白芥子”，后者习称“黄芥子”[1]。首载于《名医别录》，列为上品，其性味辛温，归肺经，具有温肺豁痰利气、散结通络止痛之功效，用于寒痰咳嗽，胸胁胀痛，痰滞经络，关节麻木、疼痛，痰湿流注，阴疽肿毒。现代研究证明白芥子含有白芥子苷、脂肪油、芥子碱、芥子酶等成分，可助机体对不正常渗出物的吸收，故临床中取其辛散走窜之力，散结消肿之功，可广泛应用于痰瘀阻络所致的内科、外科及妇科多种疾病[2]。黄芥子含芥子苷、芥子酶、芥子酸、芥子碱、脂肪油等，有平喘和抑制皮肤真菌的作用[3]，白芥子去痰平喘的功效要比黄芥子好；所以如果要用黄芥子代替白芥子时需加量使用[4]。生芥子辛散力强，善于通络止痛，但芥子油有刺鼻的辛辣味及刺激作用，能使皮肤和黏膜发生水肿、水泡，大剂量则引起强烈的胃肠道刺激。芥子炒后可缓和辛散走窜之性，避免耗气伤阴，并善于顺气豁痰，多用于痰多咳嗽。因此临床上多以其炒制品配伍入方剂，以“杀酶保苷”，发挥药效，同时炒后种皮破裂，有效成分易煎出，充分发挥其利气散结等功效[5-6]。

目前关于芥子配方颗粒的化学成分和药理研究的文献较少，尚未见对不同基原或炮制品芥子配方颗粒区别研究的报道。研究发现，以水为溶剂提取时，白芥子生、炒品的HPLC指纹图谱有显著差异，部分主峰发生了较大变化；白芥子和黄芥子的HPLC色谱图也有明显的差异[7-11]。本文以15批不同产地的白芥子和黄芥子饮片及其相应炮制品分别制备标准汤剂，并用其中3批饮片制备配方颗粒，通过UPLC法测定标准汤剂和配方颗粒指纹图谱，建立基于标准汤剂的芥子配方颗粒指纹图谱鉴别方法，为芥子配方颗粒的质量评价提供科学依据，并为进一步诠释芥子不同基原及其炮制品的科学内涵奠定基础。

1 仪器、材料与试药

Waters高效液相色谱仪(Waters H-Class，Waters公司)，Thermo高效液相色谱仪(Thermo Vanquish，赛默飞世尔科技有限公司)，Waters CORTECS T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.6μm)，ME204E万分之一天平(梅特勒-托利多公司)，KQ500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q Direct超纯水系统(默克股份有限公司)，HWS28电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)。

芥子碱硫氰酸盐(批号111702-201605，中国食品药品检定研究院，质量分数98.3%)，芥子酸(批号wkq18030911，四川省维克奇生物科技有限公司，质量分数≥98%)。15批白芥子药材、15批黄芥子药材采集于国内各产地，15批炒白芥子、15批炒黄芥子均由广东一方制药有限公司标准化部炮制，经广东一方制药有限公司质量部检测均符合2015年版《中国药典》“芥子”项下要求；15批白芥子标准汤剂、15批炒白芥子标准汤剂、15批黄芥子标准汤剂、15批炒黄芥子标准汤剂、3批白芥子配方颗粒、3批炒白芥子配方颗粒、3批黄芥子配方颗粒和3批炒黄芥子配方颗粒均来自广东一方制药有限公司，具体来源及批号见表1～2。

表1 (续)

表1 白芥子、炒白芥子及其制剂信息表 Table 1 The information of Sinapis alba and its processed products

乙醇、甲醇为分析纯；液相用磷酸、乙腈、甲醇为HPLC色谱级，水为纯净水。

表2 黄芥子、炒黄芥子及其制剂信息表Table 1 The information of Brassica juncea and its processed products

2 方法与结果

2.1 芥子标准汤剂冻干粉和配方颗粒的制备

2.1.1 标准汤剂冻干粉 按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》[12]和国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》[13]，称取白芥子饮片，煎煮2次。第1次加水8倍量，浸泡30 min，煎煮30 min，滤过；第2次加水6倍量，煎煮25 min，滤过，合并滤液，减压浓缩至饮片投料量，冷冻干燥，即得白芥子标准汤剂冻干粉，同法制备其他标准汤剂冻干粉。

2.1.2 标准汤剂配方颗粒 取白芥子饮片4 000 g，第1次加水8倍量，浸泡30 min，煎煮30 min，滤过；第2次加水6倍量，煎煮，滤过，合并滤液后浓缩成清膏(干浸膏出膏率约22%)，加入辅料适量，干燥、粉碎，再加入辅料适量，混匀，制粒，制成1 000 g白芥子配方颗粒，同法制备黄芥子配方颗粒。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters CORTECS T3(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；以甲醇为流动相A，以0.1%(体积分数，下同)H3PO4溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱程序位0～13 min，0%A→3%A；13～14 min，3%A→15%A；14～23 min，15%A→15%A；23～34 min，15%A→24%A，34～44 min，24%A→45%A；44～50 min，45%A→85%A。流速为0.25 mL/min；柱温为30 ℃；进样体积为2 μL，检测波长为278 nm。

2.3 对照品、供试品溶液的制备

2.3.1 芥子碱硫氰酸盐对照品溶液 取芥子碱硫氰酸盐对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芥子碱硫氰酸盐100 μg的对照品溶液，即得。

2.3.2 芥子酸对照品溶液 取芥子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芥子酸20 μg的对照品溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液 分别取白芥子标准汤剂、黄芥子标准汤剂、白芥子配方颗粒、黄芥子配方颗粒、炒白芥子标准汤剂、炒黄芥子标准汤剂、炒白芥子配方颗粒和炒黄芥子配方颗粒约0.1 g，精密称定，具100 mL塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率300 W，频率 50 kHz)30 min，取出，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.4 参照峰的选择

按“2.2”项下色谱条件进行梯度洗脱，芥子碱硫氰酸盐色谱峰保留时间适中，峰面积稳定，峰型较好，且峰面积大于10%，故选择芥子碱为参照峰进行各饮片、标准汤剂及配方颗粒相对保留时间的计算。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 分别取白芥子标准汤剂、黄芥子标准汤剂、白芥子配方颗粒、黄芥子配方颗粒、炒白芥子标准汤剂、炒黄芥子标准汤剂、炒白芥子配方颗粒和炒黄芥子配方颗粒粉末各0.1 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法分别制成供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件重复进样6次进行测定，计算各特征峰的相对保留时间，其RSD值均<3.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性考察 分别取白芥子标准汤剂、黄芥子标准汤剂、白芥子配方颗粒、黄芥子配方颗粒、炒白芥子标准汤剂、炒黄芥子标准汤剂、炒白芥子配方颗粒和炒黄芥子配方颗粒粉末各0.1 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法分别制成供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算各特征峰相对保留时间，其RSD值均<3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3 重复性考察 分别取白芥子标准汤剂、黄芥子标准汤剂、白芥子配方颗粒、黄芥子配方颗粒、炒白芥子标准汤剂、炒黄芥子标准汤剂、炒白芥子配方颗粒和炒黄芥子配方颗粒粉末各6份，每份0.1 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法分别制成供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算各特征峰相对保留时间，其RSD值均<3.0%，表明方法重复性良好。

2.6 白芥子、黄芥子配方颗粒UPLC指纹图谱的区别分析

分别取15批白芥子和15批黄芥子饮片，按“2.1.1”项下方法制备标准汤剂，其中3批白芥饮片(BJ13、BJ14、BJ15)制备白芥子配方颗粒，3批黄芥子饮片(HJ08、HJ09、HJ10)制备黄芥子配方颗粒，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)”(以下简称“相似度评价软件”)对15批白芥子标准汤剂和15批黄芥子标准汤剂进行匹配分析，时间窗口宽度设为0.1 min，多点校正，全谱峰匹配，按照中位数法建立各标准汤剂的对照指纹图谱共有峰模式，白芥子标准汤剂标定共有峰13个，黄芥子标准汤剂标定共有峰6个，见图1～2。设定色谱峰自动匹配，按照中位数法生成对照指纹图谱，并进行整体相似度评价，结果各标准汤剂的15批次样品与对照指纹图谱相比，相似度均大于0.99。说明所建立的对照指纹图谱具有较好的代表性，可用于标准汤剂的指纹图谱比较研究。对3批白芥子配方颗粒和3批黄芥子配方颗粒进行匹配分析，所得共有峰与标准汤剂相一致。见图3～4。

5(S).芥子碱； 13.芥子酸； S1～S15.分别为批号BJT01～BJT15的白芥子标准汤剂。

1(S).芥子碱； 6.芥子酸； S1～S15.分别为批号BJT01～BJT15的黄芥子标准汤剂。

5(S).芥子碱； 13.芥子酸； S1～S3.分别为批号BJK01～BJK03的白芥子配方颗粒。

1(S).芥子碱； 6.芥子酸； S1～S3.分别为批号HJK01～HJK03的黄芥子配方颗粒。

由图1～2可知，15批白芥子标准汤剂指纹图谱共检出13个色谱峰，各色谱峰分离效果好，且响应值较高，不同产地之间差异不明显； 15批黄芥子标准汤剂指纹图谱共检出6个色谱峰，与白芥子标准汤剂相比区别明显； 3批白芥子配方颗粒和3批黄芥子配方颗粒各共有特征峰与标准汤剂指纹图谱基本一致，具有很好的重现性，表明基于标准汤剂建立的指纹图谱可用于配方颗粒的质量评价。由图3～4可看出，白芥子配方颗粒和黄芥子配方颗粒的区别明显，两者具有共有成分芥子碱和芥子酸，黄芥子配方颗粒在芥子碱峰前没有检测到色谱峰，而白芥子配方颗粒则出现4个特征峰。

2.7 白芥子、炒白芥子配方颗粒UPLC指纹图谱的区别分析

分别取15批白芥子和15批炒芥子饮片，按“2.1.1”项下方法制备标准汤剂，其中3批白芥饮片(BJ13、BJ14、BJ15)制备白芥子配方颗粒，3批炒白芥子饮片(BJ113、BJ114、BJ115)制备炒白芥子配方颗粒，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以相似度评价软件对15批白芥子标准汤剂和15批炒白芥子标准汤剂进行匹配分析，时间窗口宽度设为0.1min，多点校正，全谱峰匹配，按照中位数法建立各标准汤剂的对照指纹图谱共有峰模式，白芥子标准汤剂标定共有峰13个，炒白芥子标准汤剂标定共有峰11个； 见图1、5。进行整体相似度评价，相似度均大于0.99。对3批白芥子配方颗粒和3批炒白芥子配方颗粒进行匹配分析，所得共有峰与标准汤剂相一致。见图3、6。

由图5～6可知，15批炒白芥子标准汤剂共检出11个色谱峰，炒白芥子配方颗粒检出色谱峰与标准汤剂一致； 对比图3与图6可发现，白芥子炒制后配方颗粒1号峰(相对保留时间为0.51)、12号峰(对保留时间为1.55)及13号峰(对保留时间为1.57)消失，3号峰(对保留时间为0.81)峰面积明显增加。

4(S).芥子碱； S1～S15.分别为批号BJT101～BJT115的炒白芥子标准汤剂。

2.8 黄芥子、炒黄芥子UPLC指纹图谱的区别分析

分别取15批黄芥子和15批炒黄芥子饮片，分别按“2.1.1”项下方法制备标准汤剂，其中3批制备黄芥子饮片(HJ08、HJ09、HJ10)制备黄芥子配方颗粒和3批炒黄芥子饮片(HJ108、HJ109、HJ110)制备炒黄芥子配方颗粒，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以相似度评价软件对15批黄芥子标准汤剂和15批炒黄芥子标准汤剂进行匹配分析，时间窗口宽度设为0.1min，多点校正，全谱峰匹配，按照中位数法建立各标准汤剂的对照指纹图谱共有峰模式，黄芥子标准汤剂标定共有峰11个，炒黄芥子标准汤剂标定共有峰8个； 见图2、7。进行整体相似度评价，相似度均大于0.99。对3批黄芥子配方颗粒和3批炒黄芥子配方颗粒进行匹配分析，所得共有峰与标准汤剂相一致。见图4、8。

3(S).芥子碱； 8.芥子酸； S1～S15.分别为批号HJT101～HJT115的炒黄芥子标准汤剂。

3(S).芥子碱； 8.芥子酸； S1～S3.分别为批号HJK101～HJK103的黄芥子配方颗粒。

由图7～8可知，15批炒黄芥子标准汤剂共检出8个色谱峰，炒黄芥子配方颗粒检出色谱峰与标准汤剂一致； 对比图4、8可发现，二者的差异主要体现在保留时间0～25 min，经炒制后在相对保留时间为0.25和0.41处新增2个峰(峰1、2)，25 min之后各色谱峰差别主要在于炒制后峰面积的变化。

3 讨论

通过系统比较研究，建立了白芥子配方颗粒和黄芥子配方颗粒及其炮制品配方颗粒的UPLC指纹图谱测定方法。对检测波长、色谱条件、供试品制备方法等进行了考察，经紫外-可见全波长(190～400 nm)扫描，发现在230、254、278 nm 3个波长下吸收最佳，在278 nm处各色谱峰较响应值较均匀，各色谱峰信号较强，基线平稳、干扰较小，因此选择278 nm作为检测波长。同时对甲醇-0.1%H3PO4、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1% H3PO4、乙腈-水及酸水溶液等不同组成的流动相进行了考察，结果以甲醇-0.1% H3PO4梯度洗脱样品分离较佳。对CORTECS T3(1.6 μm，2.1 mm×150 mm)、Agilent SB C18(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)、Waters BEH C18(1.8 μm，2.1 mm×150 mm)、Waters HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×150 mm)4种品牌色谱柱的色谱图进行比较，发现不同品牌色谱柱对各特征峰分离影响较大，使用CORTECS T3(1.6 μm，2.1 mm×150 mm)色谱柱各特征峰分离效果较好。在供试品溶液前处理中对比不同提取溶剂、提取方式及提取时间的效果，发现使用50%甲醇50 mL超声处理30 min为最佳。结果表明此法稳定、可靠、重复性好，可用于芥子及其炮制品配方颗粒指纹图谱的分析测定。

本研究选用15批饮片制备标准汤剂，其中3批制备配方颗粒，通过15批标准汤剂建立对照指纹图谱，结果发现3批配方颗粒与标准汤剂对照指纹图谱基本一致。通过分析4种配方颗粒UPLC图谱，发现白芥子、炒白芥子、黄芥子和炒黄芥子配方颗粒的UPLC图谱差异明显。白芥子和黄芥子中均以芥子碱硫氰酸盐(S峰)为主要成分，炒制后该成分的峰面积略有降低。白芥子配方颗粒指纹图谱共检出13个色谱峰，而黄芥子配方颗粒指纹图谱共检出6个色谱峰，色谱峰明显减少，在0～30 min内，白芥子配方颗粒指纹图谱共检出6个色谱峰，而黄芥子配方颗粒仅检出与芥子碱硫氰酸盐对照品相对应的色谱峰，因此可通过0～30 min来鉴别区分白芥子配方颗粒和黄芥子配方颗粒。白芥子配方颗粒与炒白芥子配方颗粒主要区别点为炒制后1号峰(相对保留时间为0.51)、12号峰(相对保留时间为1.55)及13号峰(相对保留时间为1.57)消失。黄芥子配方颗粒与炒黄芥子配方颗粒主要区别点为经炒制后在0～25 min新增2个峰(峰1、2)。

杨雪萍等[14]通过研究发现白芥子炒制后产生大量的对羟基苯乙腈，而且炒制时间越长生产的量越多； 冯宝民等[15]从炒白芥子中分离得到新化合物，并命名为白芥子醛； 芥子碱类和硫代葡萄糖苷类是芥子中主要化学成分，硫代葡萄糖苷类和芥子碱类成分热不稳定[4]，因而炮制后该类化合物发生变化。

在以往研究的基础上[10-11]，本研究建立的UPLC指纹图谱方法分离效果良好，通过指纹图谱可发现白芥子配方颗粒和黄芥子配方颗粒区别明显； 生品和炮制品之间区别明显，白芥子经炮制后1号峰消失，黄芥子经炮制后新增1、2号峰。为已失去饮片特性的芥子及其炮制品配方颗粒的质量控制提供科学依据。