补肾方药干预皮质酮所致早发性卵巢功能不全大鼠比较研究

缪梦琦，石高峰，卢燕，王佩娟，张健

补肾方药干预皮质酮所致早发性卵巢功能不全大鼠比较研究

缪梦琦1，石高峰1，卢燕2，王佩娟2，张健3

1.南京中医药大学第三临床医学院，江苏 南京 210028；2.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；3.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028

比较补肾活血方、左归丸和右归丸3种补肾方药干预皮质酮所致早发性卵巢功能不全效果。方法 50只雌性SD大鼠随机分为正常组、模型组、补肾活血方组、左归丸组、右归丸组，每组10只。皮下注射皮质酮建立早发性卵巢功能不全大鼠模型。各给药组给予相应药物干预，3周后取大鼠卵巢组织，检测血清雌二醇、卵泡刺激素、抗苗勒管激素浓度，评价卵巢功能。左侧卵巢组织HE染色观察卵巢形态，镜下进行卵泡计数；Western blot检测右侧卵巢组织Angptl4和Np4蛋白表达。与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织血清雌二醇、抗苗勒管激素浓度降低，卵泡刺激素浓度升高；卵巢颗粒细胞排列紊乱，闭锁卵泡增多，其他各级卵泡减少，Angptl4和Np4蛋白表达升高。经补肾方药干预后上述情况均有不同程度改善，其中补肾活血方效果最优。3种补肾方药均能治疗皮质酮所致早发性卵巢功能不全，其机制可能与下调卵巢组织Angptl4和Np4的表达相关。

补肾方药；皮质酮；早发性卵巢功能不全；Angptl4；Np4；大鼠

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指40岁以前月经紊乱（闭经或月经稀少）、血清促卵泡刺激素水平升高和血清雌二醇水平降低的一种临床综合征[1]。研究表明，POI可能会诱发心血管疾病、骨质疏松、神经认知功能下降，甚至导致寿命缩短[2]。有学者认为，POI发病原因以肾虚为本，治疗原则是补肾[3]。补肾活血方、左归丸和右归丸均为补肾方药，补肾活血方为江苏省中西医结合医院临床经验方，侧重于补肾活血。左归丸和右归丸均出自《景岳全书》，左归丸可滋肾阴，右归丸可补肾阳。研究表明，上述3种补肾代表方剂均可用于POI治疗[4-6]，但效果是否有所不同迄今尚未见报道。因此，本实验探究这3种补肾代表方剂干预皮质酮所致POI的效果并进行比较。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雌性SD大鼠50只，上海斯莱克实验动物有限责任公司，体质量（200±20）g，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于（24±2）℃、相对湿度（60±10）%环境，12 h/12 h明暗交替，自由摄食饮水。

1.2 主要试剂与仪器

皮质酮（CORT）试剂（批号E9ERR8XX），上海萨恩化学技术有限公司；大鼠CORT ELISA试剂盒（批号20190105）、雌二醇（E2）ELISA试剂盒（批号20190105）、卵泡刺激素（FSH）ELISA试剂盒（批号20190107）、抗苗勒管激素（AMH）ELISA试剂盒（批号20190107），武汉贝茵莱生物科技有限公司；Np4兔抗（批号Ab84598）、Angptl4兔抗（批号Ab87325），英国Abcam公司。荧光倒置显微镜（德国Carl Zeiss 公司），酶标仪（美国Bio Tek公司）。

1.3 药物及制备

补肾活血方（生地黄10 g，淫羊藿10 g，菟丝子10 g，川芎10 g，当归10 g，白芍10 g，柴胡6 g，黄柏10 g，知母10 g，牡丹皮10 g，钩藤10 g），饮片购自江苏省中西医结合医院中药房；左归丸、右归丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号分别为19060032、19070045。补肾活血方加10倍体积水，浸泡30 min，煎煮30 min，收集煎煮液，再加5倍体积水，煎煮30 min，收集煎煮液，将2次煎煮药液混合，浓缩为含原药材4.2 g/mL。左归丸和右归丸用蒸馏水配成混悬液。

1.4 分组、造模及给药

实验大鼠随机分为正常组、模型组、补肾活血方组、左归丸组和右归丸组。皮下注射CORT建立POI大鼠模型，CORT溶于生理盐水配制成4 mg/mL混悬液，按40 mg/（kg•d）剂量皮下注射。正常组注射等体积生理盐水。注射体积为1 mL/100 g，每日1次，连续21 d。造模之日起，正常组、模型组予生理盐水灌胃；补肾活血方组予补肾活血方水煎液（11.13 g/kg）灌胃，左归丸组予左归丸混悬液（1.89 g/kg）灌胃，右归丸组予右归丸混悬液（2.835 g/kg）灌胃。给药量根据人临床剂量和大鼠体表面积换算等效剂量比率表计算，大鼠灌胃体积为1 mL/100 g，每日1次，连续3周。末次给药后禁食24 h，大鼠注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心，取血清，4 ℃保存。取双侧卵巢组织。

1.5 血清皮质酮、雌二醇、卵泡刺激素、抗苗勒管激素测定

ELISA试剂盒测定血清CORT、E2、FSH、AMH浓度，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.6 病理观察

取左侧卵巢，室温10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片（厚度约5 μm），HE染色，100倍镜下观察卵巢组织形态，400倍镜下进行初级卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、闭锁卵泡计数。

1.7 Western blot检测

大鼠卵巢组织置于RIPA缓冲液中溶解，获得卵巢组织蛋白。按BCA试剂盒说明书操作，确定总蛋白含量。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，然后将蛋白质移至硝酸纤维素滤膜，室温5%牛血清白蛋白封闭1 h。随后将膜置于相应一抗中，4 ℃孵育过夜。再置于二抗中，室温孵育1 h。最后将膜置于Odyssey红外荧光扫描成像系统中扫描。以相同方式测量β-actin水平作为对照，使用Image J软件分析条带强度，计算蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 补肾方药对模型大鼠血清皮质酮、雌二醇、卵泡刺激素、抗苗勒管激素水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清CORT、FSH水平显著升高（＜0.05，＜0.01），AMH水平显著降低（＜0.05），E2水平有下降趋势，差异无统计学意义（＞0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清CORT水平显著降低（＜0.05，＜0.01），补肾活血方组大鼠血清FSH水平显著降低（＜0.05），AMH水平升高，右归丸组AMH水平升高明显（＜0.01），E2水平有上升趋势，差异无统计学意义（＞0.05）。结果见图1。

2.2 病理观察结果

模型组较正常组大鼠卵泡颗粒细胞层排列紊乱，且卵泡中卵母细胞消失，窦状卵泡数减少，闭锁卵泡显著增多，但初级卵泡、窦前卵泡和成熟卵泡均明显减少；各给药组较模型组大鼠卵泡颗粒细胞排列较为规则，大多卵泡结构完整，窦状卵泡数增加，窦前卵泡和窦状卵泡数增加，闭锁卵泡数减少，其中补肾活血方作用最显著。结果见图2、表1。

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

图2 各组大鼠卵巢组织形态（HE染色，×100）

表1 各组大鼠卵巢组织各级卵泡计数比较（±s，个）

注：与正常组比较，*＜0.05，**＜0.01；与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

2.3 补肾方药对模型大鼠卵巢组织Angptl4和Np4蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠Angptl4和Np4蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.001）；与模型组比较，各给药组大鼠卵巢组织Angptl4和Np4蛋白表达均有下调，补肾活血方组Angptl4和Np4蛋白表达显著下调，差异有统计学意义（＜0.001），左归丸组Angptl4蛋白表达显著下调，右归丸组Np4蛋白表达显著下调，差异有统计学意义（＜0.05）。结果见图3。

注：与正常组比较，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，###P＜0.001

3 讨论

POI致病原因复杂，目前90%POI病例机制仍然未知[7]。随着医学模式向生物心理社会模式的转变，以及家庭和社会压力增加，环境、社会和心理因素压力所造成的损害日益影响女性生殖内分泌功能[8-9]。中医认为，长期恼怒成火，忧思过度，会引起经血亏虚、血行不畅，经血不下，从而促使POI的发生[10]。糖皮质激素（啮齿动物中主要为CORT）的分泌增加被认为是应激反应的特定指标，且血清中糖皮质激素水平升高常被作为判断机体是否处在应激状态的客观指标[11]。Whirledge等[12]认为，糖皮质激素引起应激反应会损害卵巢功能。杜小芳等[13]认为，过量的糖皮质激素引起应激反应后会导致卵巢衰老。本研究结果表明，大鼠皮下注射CORT可造成大鼠血清CORT浓度升高，E2浓度下降，FSH浓度升高，且AMH浓度下降。

POI根据临床表现属中医学“闭经”“不孕”“血枯”“无子”“续断”等范畴。中医学认为该病与肾精亏虚、情志郁结等相关。因此，在卵巢衰老治疗中常用补肾方药[14]。本研究结果显示，补肾方药均可不同程度地改善CORT诱导的POI大鼠卵巢功能。其中左归丸和右归丸二者配方作用相似。左归丸由熟地黄、山药、枸杞子、山萸肉、菟丝子、鹿角胶、川牛膝、龟甲胶组成，右归丸由熟地黄、山药、枸杞子、山萸肉、菟丝子、鹿角胶、炒杜仲、当归、肉桂、炮附子组成。左归丸和右归丸对POI均具有改善作用可能是由于二者含有相同6味药，但右归丸相比左归丸治疗效果更好，可能是炒杜仲、当归、肉桂和炮附子的共同作用。具体机制需进一步拆方研究进行对比分析。综合实验数据表明，补肾活血方相比左归丸和右归丸其治疗效果最优。因此推测在治疗POI时，从补肾活血的角度施治可能会取得更好的效果。其结果进一步表明POI主要的中医病机可能为肾虚血瘀。

为了探究补肾活血方治疗皮质酮所致POI的机制，本课题组前期利用蛋白组学发现一些蛋白质的变化，结果显示，模型组较正常组大鼠卵巢组织Angptl4和Np4蛋白表达显著上调，补肾活血方组较模型组Angptl4和Np4蛋白表达显著下调。根据实验结果推测，这2个蛋白与POI的发病及治疗相关。因此，本研究比较3种补肾方剂治疗POI的效果，并进一步对比三方对Angptl4和Np4蛋白表达的影响。Western blot结果表明，补肾方药均可降低大鼠卵巢组织Angptl4和Np4蛋白表达，表明Angptl4和Np4上调可能是POI的重要环节，下调卵巢Angptl4和Np4的表达可能是治疗该疾病的标志信号，其中补肾活血方效果最优。

综上，本研究显示，补肾活血方、左归丸和右归丸对皮质酮诱导POI模型大鼠均有改善作用，但作用效果存在差异，其机制可能与下调卵巢组织Angptl4和Np4的表达相关，但Angptl4、Np4与POI之间的关系需今后进一步的实验探索。

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Comparative Study on Effect of Tonifying Kidney Prescriptions on Corticosterone Induced Premature Ovarian Insufficiency Rats

MIAO Mengqi1, SHI Gaofeng1, LU Yan2, WANG Peijuan2, ZHANG Jian3

To compare the effects ofPrescription,Pills andPills on the treatment of corticosterone induced premature ovarian insufficiency.Totally fifty female SD rats were randomly divided into normal group, model group,Prescription group,Pills group andPills group, with 10 rats in each group. Premature ovarian insufficiency rat model was established by subcutaneous injection of corticosterone. Each administration group was given relevant medicine for intervention. Three weeks after modeling and administration, ovarian histological analysis and the concentrations of estradiol, follicle stimulating hormone, and anti-Mullerian hormone were used to evaluate ovarian function. The ovarian morphology and count follicles with HE staining microscopy on the left ovary tissue were observed. Western blot was used to detect the expression of Angptl4 and Np4 protein in the right ovarian tissue.Compared with the normal group, the concentration of estradiol and anti-Mullerian hormone decreased in the model group, and the follicle stimulating hormone concentration increased; the ovarian granulosa cells were disorderly arranged, the atretic follicles increased, the follicles at other levels decreased, and the expression of Angptl4 and Np4 protein increased. The above conditions were improved after the intervention of the three tonifying kidney prescriptions, and the effect ofPrescription was the best.The three prescriptions can treat corticosterone induced premature ovarian insufficiency. The mechanism may be related to the down-regulation of expressions of Angptl4 and Np4 in ovarian tissue.

tonifying kidney prescriptions; corticosterone; premature ovarian insufficiency; Angptl4; Np4; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)08-0063-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202002499

江苏省社会发展重点项目（BE2019766）；江苏省研究生科研创新计划（KYCX19_1279）

张健，E-mail：zjwonderful@hotmail.com

（2020-02-26）

（2020-03-27；编辑：华强）