硫酸乙酰肝素在哺乳动物肺发育中的功能

陈娅萍 陆紫云 宋双 张婷 张天天 崔浩

摘要：在早期胚胎发育过程中，哺乳动物肺发育经历了气管分支形态发生、上皮管道形成、血管生成、肺泡分化等过程。这些过程受到各种激素、生长因子以及形态发生素等蛋白的严格调控。硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）是一类高度异质性的带负电荷的大分子糖胺聚糖，其主要位于细胞表面以及细胞间质中。HS通过与蛋白相互作用参与哺乳动物发育过程。多年来，大量研究工作表明，HS与多种生长因子、趋化因子、形态发生素等蛋白结合后参与肺发育过程的调控。本文根据目前最新的研究进展，阐述了HS糖链精细结构与肺发育过程的关系。

关键词：硫酸乙酰肝素;哺乳动物肺发育;功能

一、哺乳动物肺发育

从胚胎发育成为具有自主呼吸能力的新生儿是哺乳动物如人类发育的重要过程。在子宫内，胚胎肺部血流量低，氧合作用主要通过胎盘的气体交换完成。出生后，新生儿心血管循环模式发生改变，肺部血流量大幅增高，从而代替胎盘进行气体交换。然而，如果肺部发育不成熟或肺部发生损伤，可造成肺泡表面积减少，肺血流供应不足，导致气体交换功能受损和新生儿呼吸衰竭的发生[1]。

哺乳动物肺首先从内胚层前肠以上皮肺芽的形式出现。原始的肺芽不断生长延伸到周围间质中，形成相互连通的各级气管并在细支气管末端形成短管束。短管束進一步分支后扩展形成终末导管，与此同时肺泡和血管开始发育，终末导管进一步扩大构成原始肺泡。原始肺泡分隔和重建后，肺泡数量和表面积大幅增加，形成成熟的肺泡[2]。大量研究表明肺分支形成过程中，上皮与间充质之间的相互作用至关重要，肺上皮生长和分化受到发自间充质的信号的调控。在此过程中，相关基因的表达受到各种转录因子和生长因子的时空调控[3]。

二、硫酸乙酰肝素

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS），是一类结构复杂的含有硫酸基团的带负电荷的糖胺聚糖。HS与核心蛋白共价结合形成蛋白聚糖（proteoglycan）（如Syndycans，Glypicans和Perlecan等），广泛存在于细胞表面和细胞外基质中。大量研究显示，HS糖链可与上百种蛋白如生长因子、细胞因子等相互结合，参与胚胎发育，正常生理平衡以及老年痴呆、病毒感染、炎症、肿瘤发生发展和转移等多种生理病理过程的调节。HS与各种蛋白结合的能力与其糖链的精细结构密切相关[4]。

HS糖链的生物合成是通过多达20多种催化酶在高尔基体内对底物的协调加工完成的。首先，特征四糖片段（GlcAGalGalXyl）在糖基转移酶的作用下与核心蛋白的丝氨酸（Ser）残基连接。而后，聚合酶EXT1/EXT2催化延伸HS糖链形成由[GlcAβ1，4GlcNAcα1，4]二糖重复单元组成的骨架糖链。最后经过一系列的修饰反应，包括GlcNAc的N去乙酰N硫酸化（NDST），GlcA差向异构化为IdoA（HSepi），己糖醛酸C2位的硫酸化（2OST），以及葡萄糖胺的C6位（6OST）和C3位（3OST）的硫酸化。迄今为止，已经发现4种NDST同工酶，3种6OST和7种3OST，1种HSepi和2OST，参与人体细胞HS糖链的修饰。HS糖链的修饰反应具有一定的时序性，例如，起始修饰阶段，关键酶NDST对GlcNAc进行N脱乙酰N硫酸化形成N硫酸化结构域后才能够被C5差向异构化和O硫酸化修饰[4]。

三、HS糖链结构高度多样化

HS生物合成的复杂性决定了其结构和生物学功能的多样性，这些HS糖链结构和功能的差异是由于参与HS合成的酶的表达谱在不同生理或病理状态（如组织/细胞类型、分化、生长或病理状态）下的差异决定的。例如在小鼠胚胎发育过程中，HS糖链存在发育阶段和组织特异性的结构改变。未分化的胚胎干细胞显示低硫酸化修饰的HS结构，而分化的神经前体细胞表达较高硫酸化的HS，其中糖链的N和6O硫酸化修饰程度显著提高。研究显示，在小鼠大脑胚胎发育过程中，HS糖链的链长和硫酸化修饰模式呈动态变化[5]。

四、HS糖链在肺发育中的作用

肺发育过程中，大量细胞生长因子、形态发生素等蛋白通过介导上皮间充质相互作用，从而诱导上皮分化和促进肺间充质的增殖、分化和模式化。研究显示，HS糖链通过与这些蛋白因子相互结合，调节其运输过程或生物活性，从而参与肺部发育。HS糖链修饰酶发生突变可导致肺发育缺陷。例如，NDST1基因敲除小鼠表现严重的脑部、面部、眼睛和骨骼发育异常，突变小鼠出生后迅速死于肺功能不全。进一步研究显示，敲除NDST1基因可导致肺泡间隔增厚以及II型肺细胞成熟障碍（分泌表面活性蛋白以启动和维持肺泡扩张）。在果蝇中，NDST1同源物sulfateless突变可引起气道发育障碍。机理研究表明，sulfateless突变显著降低了FGF诱导的MAPK信号通路活性，从而导致气管细胞迁移和分支形态发生缺陷。我们的研究结果表明，敲除C5差向异构酶基因HSepi后，细胞合成的HS糖链仅含有GlcA而不含IdoA。HSepi敲除小鼠具有肾脏发育不全、骨骼畸形、眼睛发育缺陷和肺发育不成熟等表型，出生后由于呼吸窘迫而死亡。HS糖链6O硫酸化修饰在气管发育中同样重要，利用RNAi抑制果蝇6OST表达可降低FGF诱导的MAPK信号通路活性，导致气管分支障碍和胚胎死亡。然而，在小鼠模型中，敲除6OST1基因对小鼠胚胎肺发育或分支形态发生没有影响，但小鼠出生后，表现肺泡发育缺陷、肺泡体积和不规则弹性蛋白沉积增加等症状[6，7]。

利用胚胎肺组织块体外培养模型，多个实验室证明了HS糖链在肺形态发生中的重要功能。利用肝素酶裂解E11.5小鼠上皮组织块中（无间充质）的HS糖链可致其迅速死亡，而未添加FGF10生长因子培养的肺可导致类似现象，这表明去除HS糖链可能破坏了FGF信号转导从而导致肺发育障碍。与此呼应，研究显示，在E11E13胚胎小鼠肺中，FGF10蛋白的表达与肺分支活跃区域中HS糖链表达相关。此外，在肺上皮细胞或全肺组织块培养基中添加肝素可改变FGFs诱导的形态发生的活性。体外肺组织块培养试验结果显示，低剂量肝素可一定程度上增强上皮分枝。而高浓度肝素处理可同时调控支气管平滑肌细胞分布和分支形态发生。同样利用肺组织块体外培养模型，通过氯酸钠抑制HS糖链硫酸化或在培养基添加过量的O硫酸化肝素可干扰FGF10与上皮细胞结合以及FGF10的生物活性，最终抑制BMP4的表达和阻碍肺分支的形成。此外，向氯酸钠处理的肺组织块培养基中添加仅含N硫酸化修饰的肝素（去O硫酸化）不能恢复FGF依赖的生存和生长，而添加过量或部分O硫酸化修饰的肝素可以修复氯酸钠处理导致的肺分支障碍。这些证据表明O硫酸化修饰对HS糖链参与肺部的发育至关重要[6，7]。

五、结语

HS糖链通过储存或聚集各种生长因子以及充当受体或辅助受体等多种机制调控细胞信号的转导，从而参与分支器官特别是肺发育的过程。HS的调节功能受到其糖链精细结构的影响。因此，阐明HS糖链结构与肺部发育关系可为靶向生长因子或者细胞层面的肺组织再生和修复研究提供重要参考。

参考文献：

[1]Kinsella，J.P.，A.Greenough，and S.H.Abman，Bronchopulmonary dysplasia.Lancet，2006，367（9520）：14211431.

[2]Metzger，R.J.，et al.，The branching programme of mouse lung development.Nature，2008，453（7196）：745U1.

[3]Warburton，D.，Developmental biologyOrder in the lung.Nature，2008，453（7196）：733735.

[4]J.P.Li，M.K.G.，Heparan Sulfate Biosynthesis，Structure，and Function International Review of Cell and Molecular Biology，2016，325：215273.

[5]Poulain，F.E.and H.J.Yost，Heparan sulfate proteoglycans：a sugar code for vertebrate development？ Development，2015，142（20）：345667.

[6]Patel，V.N.，D.L.Pineda，and M.P.Hoffman，The function of heparan sulfate during branching morphogenesis.Matrix Biol，2016.

[7]Thompson，S.M.，et al.Heparan sulfate in lung morphogenesis：The elephant in the room.Birth Defects Res C Embryo Today，2010，90（1）：3244.

基金項目：2018年国家级大学生创新创业训练计划项目（项目编号：201810414010）

作者简介：陈娅萍（2000—），女，汉族，湖南耒阳人，本科，研究方向：糖生物学。

*通讯作者：崔浩（1985—），男，汉族，江苏人，博士，副教授，研究方向：糖生物学。