基于茎材解剖结构的茶树树龄测定方法

江燕，黎星辉，浦滇，蓝增全，吴田*

基于茎材解剖结构的茶树树龄测定方法

江燕1，黎星辉2，浦滇3，蓝增全4*，吴田1*

1. 西南林业大学国家林业与草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南 昆明 650224；2. 南京农业大学茶叶科学研究所，江苏 南京 210095；3. 西南林业大学生态与水土保持学院，云南 昆明 650224；4. 西南林业大学绿色发展研究院茶生态研究中心，云南 昆明 650224

以茶树为研究对象，采用茶树茎材切片及染色技术，在生物数码显微镜的普通光和荧光下，对未处理的茶树茎材切片、番红染色茶树茎材切片及吖啶橙染色茶树茎材切片进行比较与分析。结果表明，茶树茎材切片使用吖啶橙染色后在普通光和荧光下确定树龄的效果较好。这种基于数字图像确定茶树树龄的吖啶橙染色法，具有快速、准确、简单和成本低等特点，对大茶树和古茶树活体生长锥取样年轮条的年轮识别具有科学参考意义。

茶树茎材切片；染色技术；荧光；年轮；数字图像

茶树[(L.) O. Kuntze]属山茶科（Theaceae）山茶属（L.），起源于我国西南地区，至今已有三千多年的栽培历史[1]。中国茶树种质资源丰富，特别是云南聚集着大量茶组植物（Section Thea）[2-4]，其中有许多不同类型的大茶树。同样，在中国、印度和东南亚的其他许多地方也都发现了大茶树。由于消费市场对大树茶和古树茶的青睐，人们期望了解茶树的真实树龄。目前，茶树树龄的鉴定方法主要有文献追踪法、访谈传说法、类推法、CT扫描法、生长锥法、Java年轮分析系统等方法[5-6]，这些方法各有优缺点，基于年轮计数的树龄判定方法得到人们的普遍认同。树木在一个生长周期内形成的一圈木质环轮是它的年轮，年轮的形成受到自身遗传特性和环境条件的影响[7]。树木受到环境因素影响致使年轮宽窄不同，如春季细胞分裂速度快、体积大、细胞壁薄、材质松软、材色较浅；秋季细胞活动逐渐减小，细胞分裂速度减慢，体积小，材色较深[8]。年轮变异主要有伪年轮或多层轮、断轮、年轮丢失等[9]。这些年轮变异的情况会影响茶树树龄鉴定的准确性。

树木细胞的特征被证实能够提供与环境相关的重要信息[10]，年轮的分析对历史、气候等科学研究方面也具有重要价值[11]。年轮特征识别作为年轮分析的基础，其识别的质量直接影响分析结果的准确性[12]，年轮早晚材的准确分割是年轮计数和间距测量的前提条件[13]。在树木年轮的研究中，图像处理技术被广泛应用[14]，年轮鉴定分析手段趋于多样化。目前常用的年轮测量方法或仪器存在着测量难度大、仪器专业性强、测量成本较高等问题。研究出一种测量精度和性价比较高的年轮分析方法对年轮研究具有积极意义[15]。根据树木生长基本原理、树木早晚材[16]、年轮[17]、年轮取向[18]、年轮边界[19]等特征，应用染色技术，结合现代数字图像技术分析茶树茎材解剖结构[20]，是一条更精准识别茶树年轮的有效途径。

在木材解剖结构分析中通常采用番红、固绿等进行染色，本试验采用了生物细胞染色中用到的吖啶橙染色法[21]。使用吖啶橙（AO）核酸染料进行试验，利用核酸染料的光谱特性[22]，使染色的茎材切片在特定光下激发出荧光，于生物数码显微镜下进行茎材切片的观察，比较分析不同染色方法识别茶树年轮的效果，旨在为茶树树龄鉴定提供一种精确的科学方法。

1 材料与方法

1.1 研究地点和环境

样本于中国茶区内采集，共涉及7个地区：西藏自治区林芝市、云南省西双版纳傣族自治州、云南省昆明市、贵州省六盘水市、四川省成都市、湖北省黄冈市、广西省南宁市。海拔范围为350~2 300 m，年均降水范围为650~1 513 mm，年均气温范围为8.7~22.6℃。采集地点具有一定的代表性，环境气候类型多样，茶树样本差异性较大（表1）。

1.2 试验材料及预处理

试验仪器：MY-12CH402AMidea高压锅（广东美的生活电器制造有限公司），SM2000RLeica滑走式切片机（北京海天友诚科技有限公司），ECLIPSE80iNikon生物数码显微镜及NIS-Elements BR图像采集系统（上海衡浩仪器有限公司）。

试验试剂：番红购自福州飞净生物科技有限公司，吖啶橙购自上海麦克林生化科技有限公司，丙三醇和二甲苯购自昆明硕阳科技有限公司，无水乙醇购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中性树胶购自中国上海标本模型厂。番红染色液的配制：称取1 g番红粉末加50%乙醇定容至100 mL，避光保存。吖啶橙染色液的配制：取称1 g吖啶橙粉末加蒸馏水定容至100 mL，避光保存。

本试验中的样本均为茶树[(L.) O. Kuntze]，基于保护茶树的原则，取样时选择已死亡的茶树。以贵州省六盘水市茶树样本为例，沿茶树基部截取树干后取厚度约2 cm的木段（图1-a），用80~1 200目砂纸将茶树横截面打磨光滑。以茶树髓心为中心，进行四等分，长度为髓心至树皮，宽度约8 mm的样本，经切割后得到4个方向的样本（图1-b）。

将切好的四等分茶树样本在高压锅（温度100℃，压力80 kPa）中纯水焖煮2 h，保温10 h，对茶树样本进行软化处理。使用滑走式切片机，对软化过的茶树样本从髓心至树皮取完整的切片，切片厚度为30~40 μm，每个样本选择3片切片。

表1 茶树样本所处环境基本信息

注：a：基部茶树样本；b：均分的茶树样本

1.3 茶树茎材切片处理

茶树样本切片分别做3种处理：处理一（对照）的切片不染色，使用丙三醇封片（图2-a）；处理二的切片使用番红染色，在番红染色液中浸泡4 h，经不同浓度乙醇（50%、75%、95%、100%）、二甲苯依次脱水，每步5 min，最后用中性树胶封片，凝固后可永久保存（图2-b）；处理三的切片使用吖啶橙染色，在吖啶橙染色液中浸泡5 min，经不同浓度乙醇（50%、75%、95%、100%）依次脱水，每步5 min，使用丙三醇封片（图2-c）。

考虑茶树显微构造分子的轮廓清晰度和所获图像的视野范围，本研究中Nikon生物数码显微镜的物镜采用2~20倍，目镜采用10倍，光照采用了普通光和荧光。Nikon生物数码显微镜的荧光选择了UV-2A档，光照波长为330~380 μm，在此波长范围内，年轮识别效果最佳。在NIS-Elements BR数字成像系统中识别茶树茎材横截面解剖结构，识别茶树年轮过程中使用该数字成像系统拍照，图像精度为1 280×960像素。

2 结果与分析

2.1 未染色茶树茎材切片

以贵州省六盘水市茶树样本为例，未经任何染色处理的茶树茎材解剖切片，使用Nikon生物数码显微镜4（物镜）×10（目镜）倍观察。在普通光照下，茎材呈现出原本的颜色，可见其年轮和导管，但清晰度不够，且受茎材切片厚度影响而未达到最佳识别效果（图3-a）。在UV-2A荧光照射下，年轮早材管孔比晚材管孔大，可判定茶树属于环孔材，从早材到晚材的导管变化比较明显，年轮界限可见（图3-b）。所有图中标注1的部分为早材，2为晚材，年轮界限使用黑色实心三角形标注。

2.2 番红染色茶树茎材切片

经番红染色过的茶树茎材切片，使用Nikon生物数码显微镜4（物镜）×10（目镜）倍，在普通光照下，切片呈现出红色，可以直观看出年轮界限和导管变化，早材、晚材过渡区可以识别（图4-a）。在UV-2A荧光照射下，番红染色的切片呈现出褐色，无法对所有年轮界限进行识别（图4-b）。

注：a：未染色茶树茎材切片；b：番红染色的茶树茎材切片；c：吖啶橙染色的茶树茎材切片

注：a：普通光下4×10倍未染色茶树茎材切片；b：荧光下4×10倍未染色茶树茎材切片

注：a：普通光下4×10倍番红染色茶树茎材切片；b：荧光下4×10倍番红染色茶树茎材切片

2.3 吖啶橙染色茶树茎材切片

经吖啶橙染色后的茶树茎材切片，在数字图像识别系统下易于识别。其年轮、早材、晚材、导管、轴向薄壁组织、胞间道和木射线等清晰，切片颜色变为黄绿色。使用Nikon生物数码显微镜4（物镜）×10（目镜）倍，在普通光照下，切片呈现出亮黄色，导管分明，年轮界限清晰（图5-a）。使用UV-2A荧光照射，切片呈现出带荧光的绿色，年轮界限可见（图5-b）。切片的导管和年轮界限清晰，早材和晚材的导管大小具有比较性，年轮易识别。吖啶橙染色的茎材切片在普通光与荧光下均呈现出较好的识别效果，但前者容易受到切片厚度的影响而不能识别全部年轮。将吖啶橙茶树茎材切片4×10倍的普通光图片和荧光图片用Photoshop图像处理软件拼接后，从髓心至树皮部分的年轮清晰可见（图5-c、图5-d），可以判定该茶树树龄为26年。

2.4 茎材切片拼接图的比较与分析

通过茶树茎材切片染色方法可以鉴定出贵州省六盘水市茶树的树龄，使用其他地区的茶树样本进行验证。对其他地区的样本切片后进行未染色、番红染色和吖啶橙染色处理，在生物数码显微镜下分别用普通光和荧光进行观察和拍照。使用Photoshop图像处理软件对茶树4个方向的年轮图片进行拼接，拼接图片包括茶树髓心至树皮的全部年轮。考虑到每个方向年轮图片的相似性，故文中每个样本只展示了1个方向的年轮图片（图6）。

所有茶树样本中，吖啶橙染色的茎材切片，在普通光下，100~1 000 μm识别范围中，年轮边界清晰（图7）；在荧光下，500~1 000 μm识别范围中，黄色的年轮边界清晰；200 μm识别范围中，大小导管在年轮边界处过渡，木射线可见；100 μm识别范围中，导管、薄壁细胞、木纤维、木射线明晰，年轮边界的木纤维呈现黄色（图8）。结果表明，吖啶橙染色法是茶树年轮鉴定的一种可行方法。

将打磨过的茶树样本与吖啶橙染色后的茶树茎材切片进行年轮点数，人眼识别打磨过的茶树横截面（图9-a），荧光显微镜下识别吖啶橙染色茶树茎材切片（图9-b）。每个茶树样本的4个方向均采用了以上两种方法确定树龄。显微镜识别年轮与人眼识别年轮存在差异（表2），人眼识别的年轮数目均比显微镜识别的年轮个数少，存在1.5~3.5年的误差。故在本试验材料中，使用吖啶橙染色技术点数茎材切片年轮的方法可以提高树龄鉴定的精确度。

注：a：普通光照下4×10倍吖啶橙染色茶树茎材切片；b：荧光下4×10倍吖啶橙染色茶树茎材切片；c：普通光下4×10倍吖啶橙染色茶树茎材切片拼接图；d：荧光下4×10倍吖啶橙染色茶树茎材切片拼接图

注：A：普通光显微镜下未染色茶树茎材切片拼接图；B：荧光显微镜下未染色茶树茎材切片拼接图；C：普通光显微镜下番红染色茶树茎材切片拼接图；D：荧光显微镜下番红染色茶树茎材切片拼接图；E：普通光显微镜下吖啶橙染色茶树茎材切片拼接图；F：荧光显微镜下吖啶橙染色茶树茎材切片拼接图。a：西藏林芝；b：云南西双版纳；c：云南昆明；d：湖北黄冈；e：四川成都；f：广西南宁

图7 普通光显微镜下不同识别范围的吖啶橙染色茶树茎材切片

图8 荧光显微镜下不同识别范围的吖啶橙染色茶树茎材切片

注：a：人眼识别打磨过的茶树茎材橫截面；b：显微镜识别吖啶橙染色的茶树茎材切片

表2 茶树样本的年轮信息

注：A：人眼识别茶树茎材横截面的年轮数；B：显微镜识别吖啶橙茎材切片的年轮数。1：西藏林芝；2：云南西双版纳；3：云南昆明；4：贵州六盘水；5：湖北黄冈；6：四川成都；7：广西南宁

Note: A: Identification of annual rings of cross section of tea stem by human eyes. B: Identification of annual rings in stem section of Acridine Orange by microscope. 1: Tibet Linzhi. 2: Yunnan Sipsongpanna. 3: Yunnan Kunming. 4: Guizhou Liupanshui. 5: Hubei Huanggang. 6: Sichuan Chengdu. 7: Guangxi Nanning

3 讨论

陈涛林等[23]在柳州古茶树树龄研究中，对茶树采用生长锥法取芯后浸泡在FeCl3溶液中，处理后的树芯年轮边界呈现蓝色，然后通过人眼识别年轮，鉴定树龄。但茶树年轮细密且不清晰，鉴定树龄的准确性仍需提高。与其相比，本试验采用吖啶橙染色后通过荧光显微镜识别年轮的方法对7棵直径范围为3.00~7.23 cm的茶树进行分析，鉴定出树龄为10~29年，1 cm树芯年轮数为6~10年，在识别效率和精确度上均有所提高。基于保护茶树的原则，本试验所有试材均为已死亡的茶树，未采集活体茶树试材。该方法在一定程度上对活体大茶树、古茶树的树龄鉴定同样具有参考意义，可采用生长锥取得树芯进行适当染色后在荧光显微镜下确定树龄。

荧光显微镜技术是利用特定波长照射被测物质，在显微镜下加以检视的方法[24-25]。吖啶橙染色后的茶树茎材切片在荧光照射下，茎材切片被激发出荧光，可清晰识别年轮特征。吖啶橙是经典的灵敏荧光染料，染色后需立即观察，否则会因荧光逐渐减弱而影响识别效果。本试验中使用吖啶橙染色方法处理过的茶树茎材切片，在数字图像系统中呈现出最好的识别状态。该方法对茶树木材进行解剖、切片、染色的技术简便，使用的仪器常见，经济成本较低，可以有效地对茶树年轮进行准确鉴定，可用于各地区茶树树龄确定，进而对茶树的历史、环境、生态、气候等诸多方面提供依据。

茶树不仅具有较高的经济价值，还有用重要的文化价值和科研价值[26]。目前人们对古茶树树龄的争议较大，应当根据科学数据客观判定树龄。大茶树或古茶树的价值不在于它的树龄，而在于它资源的稀有性和重要性[27]，科学地鉴定茶树树龄工作对于大茶树和古茶树的保护、宣传和利用都具有重要意义。

致谢：衷心感谢扬州大学博士生导师王莉教授的专业建议和指导，感谢中国农业科学院茶叶研究所陈亮研究员的专业指导，感谢西南林业大学木材标本馆博士生导师邱坚教授的试验指导和硕士研究生王云龙在试验上给予的帮助。

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A Preliminary Study on Determining Tea Plant Age Based on Anatomical Structure of Tea’s Stem

JIANG Yan1, LI Xinghui2, PU Dian3, LAN Zengquan4*, WU Tian1*

1. Southwest Landscape Architecture Engineering Research Center of State Forestry Administration, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Tea Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. School of Ecology and Soil and Water Conservation, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 4. Tea Ecology Research Center, Southwest Green Development Institute, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China

Tea plants were taken as the research objects in this study. Using tea stem slicing and dyeing technologies, the age of tea plants was accurately determined based on the digital images. Under ordinary light and fluorescence of bio-digital microscope, the untreated sections of tea stem, saffron-dyed sections and acridine orange-dyed sections of tea stem were compared and analyzed. The result shows that acridine orange dyeing was the best to determine the age of tea plants. The acridine orange dyeing method combined with digital image analysis had the characteristics of fast, accurate, simple and low cost. In conclusion, the technology also had a scientific reference significance for the identification of annual rings of living large and ancient tea plants.

stem slices of tea plant, dyeing technology, fluorescence, growth ring, digital image

S571.1

A

1000-369X(2020)04-492-09

2019-09-19

2019-10-30

国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-19）、国家自然科学基金（31470690）、古茶树保护与可持续利用国家创新联盟([2018]96）、云南省教育厅财政厅项目（LY2017-002）

江燕，女，硕士研究生，研究方向植物资源与应用。

lzq@swfu.edu.cn；wutianpotato@swfu.edu.cn

投稿平台：http://cykk.cbpt.cnki.net