气相色谱-负化学源-串联质谱法测定动物源食品中氟虫腈及其4种代谢产物残留量

韩 超，胡贝贞，金 娜，刘 滨，沈 燕，金建昌，陈树兵*

（1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015；2.绍兴海关综合技术服务中心，浙江 绍兴 312000；3.温州海关综合技术服务中心，浙江 温州 325027；4.宁波海关技术中心，浙江 宁波 315040）

氟虫腈是世界上首个苯基吡唑类杀虫剂，也是一种广谱杀虫剂，能够有效杀死跳蚤、虱子等生物[1-2]。世界卫生组织表示，人类食用含有一定浓度的氟虫腈食品，会损伤肾脏和肝脏，因而被世界卫生组织列为“对人类有中度毒性”的化学品[3]。另外，氟虫腈化学性质较为活泼，在环境中经水解和光解作用，能够产生代谢产物氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈硫醚，代谢产物的毒性远高于母体氟虫腈。美国对鸡蛋中的氟虫腈的限量要求为0.02 mg/kg，欧盟规定氟虫腈不得用于人类食品产业链的畜禽养殖过程，对所有食品的限量要求均为0.005 mg/kg。GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》，规定了氟虫腈及代谢产物氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈硫醚之和在禽肉、禽蛋、禽内脏的限量要求分别为0.01、0.02、0.02 mg/kg。酰胺氟虫腈尽管未被GB 2763—2019列入监控范围，国外已有报道在秋葵及蜂蜜和花粉中将酰胺氟虫腈作为氟虫腈代谢产物进行检测[4-5]。

目前国内外对氟虫腈及其代谢产物的测定主要有气相色谱法[6-9]、气相色谱-质谱法[10-12]、气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）法[13-14]、液相色谱法[15]、液相色谱-串联质谱法[16-21]和免疫分析法[20-23]。由于含有多个卤原子，氟虫腈及其代谢物的电负性极强，适用于负化学源（negative chemical ionization，NCI）测定，同时样品溶剂和仪器本底中氧、硫等杂原子响应值低，由此提高了信噪比，目前已有文献报道采用GC-NCI-MS/MS对氟虫腈及其代谢产物的测定[24-25]。GC-MS/MS法多反应监测（multireaction monitoring，MRM）模式实现了在复杂基质背景下对目标物的准确测定。有关动物源食品（禽肉、禽蛋、禽内脏）中氟虫腈及其4 种代谢产物（氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚、酰胺氟虫腈）残留的GC-NCI-MS/MS同时测定鲜见报道。QuEChERS由于其具有简便、快速、环境友好、试剂消耗少等优点，在食品农、兽药残留分析中得到了广泛的应用[26-27]。本研究采用QuEChERS法结合GC-NCI-MS/MS同时测定动物源食品（鸡蛋、鸡肉、鸡肝）中氟虫腈及其4 种代谢产物（氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚、酰胺氟虫腈）残留量，该方法灵敏度高、选择性好，能够满足动物源食品中氟虫腈及其4 种代谢产物残留量的确证和定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋、鸡肉、鸡肝市购。

氟虫腈标准品（CAS 120068-37-3，纯度97.5%）、酰胺氟虫腈（CAS205060-69-7，纯度97.5%）、氟甲腈（CAS205060-65-3，纯度98.0%）、氟虫腈砜（CAS120068-36-2，纯度98.5%）、氟虫腈硫醚（CAS 120067-83-6，纯度98.0%） 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；各个化合物结构见图1。

图1 氟虫腈及4 种代谢物的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of fipronil and four metabolites

乙腈、正己烷（均为色谱纯） 德国Merck公司；盐析包（含4 g硫酸镁、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸钠半水合物、1 g氯化钠）和净化管（含150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA、50 mg C18） 月旭科技（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Trace 1300-TSQ 8000三重四极杆GC-MS联用仪（配有NCI）、ST16 R离心机 美国Thermo公司；GM 200组织捣碎机 德国莱驰公司；MS 105DU电子天平、PL 203电子天平 美国梅特勒-托利多公司；T18型均质器德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 试样制备

取有代表性样品500 g，将其切碎后，用组织捣碎机将样品加工成浆状，混匀，装入洁净的盛样容器内，密封并标明标记。称10 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈（正己烷饱和），15 000 r/min高速均质2 min后加入盐析包，剧烈振摇2 min，10 000 r/min高速离心5 min，取1 mL乙腈层提取物于10 mL离心管中，加入1 mL正己烷（乙腈饱和）涡旋混匀，静置分层，弃去正己烷层，加入1 mL正己烷重复一遍。取乙腈层加入到2 mL净化管中，涡旋振荡2 min，10 000 r/min高速离心5 min，取上清液供GC-NCI-MS/MS测定。

1.3.2 标准溶液配制

分别称取每种适量标准品，用乙腈制得100 μg/mL标准储备液。按1.3.1节方法制备不含待测组分的空白基质溶液，配制质量浓度分别为1、2、5、20、50、100 μg/L的系列基质标准工作溶液。

1.3.3 GC条件

HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：初温60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至200 ℃，再以15 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。进样口温度240 ℃，不分流进样，进样量1 μL，载气为氦气（纯度≥99.999%），流速1.0 mL/min。

1.3.4 MS条件

电离模式：NCI，反应气为甲烷（纯度≥99.99%）；电离能量70 eV；离子源温度200 ℃；传输线温度250 ℃；MRM模式，具体条件见表1。

表1 目标物的MRM分析条件Table 1 MRM MS conditions for target compounds

2 结果与分析

2.1 质谱参数的优化

由于氟虫腈及其4 种代谢产物分子结构中（图1）都含有6 个氟原子、2 个氯原子，具有较强的电负性，在离子源内容易形成负离子。NCI属于软电离技术，具有较低噪声背景的巨大优势，因此选用对含电负性基团有特异响应的NCI技术进行测定是最好的选择[28]。采用NCI源在SCAN模式下，对5.0 mg/L的氟虫腈及其4 种代谢产物分别进行一级质谱全扫描分析，得到每个目标物的母离子。在不同碰撞能量下，对目标物的母离子分别进行二级质谱扫描，得到每个母离子的碎片离子，选择丰度较高的3～4 个子离子，配制不同种类的空白样品基质标准溶液，在MRM模式下优化各种质谱条件，剔除易受杂质干扰，选择丰度最高的2 个子离子作为定量离子和定性离子，优化后的质谱参数见表1。

2.2 样品前处理条件的优化

鸡蛋、鸡肉和鸡肝等动物源样品含有的一定量脂肪和蛋白质。本实验采用乙腈提取、高速离心，可以去除蛋白质的影响。对所含的脂肪，需对QuEChERS提取和净化进行改进，采用3 个步骤去除脂肪：第1步样品提取的时候采用正己烷饱和的乙腈，以减少脂肪溶解在乙腈中；第2步采用乙腈饱和的正己烷液液分配2 次去除脂肪，第3步净化管中含有C18粉，可用于进一步去除脂肪。由于本实验采用GC-MS/MS的NCI源和MRM模式，具有高选择性和灵敏度，在此模式下得到的空白鸡蛋样品基质标准溶液的总离子流色谱图中目标物出峰处无杂质干扰（图2）。

图2 空白鸡蛋基质标准溶液（2200 μgg/L）的总离子流色谱图Fig. 2 Total ion current chromatograms of mixed standard solution(20 μg/L) with blank egg matrix

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系与定量限

采用基质匹配工作曲线以最大消除基体效应对定量结果的影响。采用外标法对1.3.2节制备的1、2、5、20、50、100 μg/L系列基质标准工作溶液进行上机测定，以各组分的定量离子的峰面积为纵坐标（Y），其质量浓度为横坐标（X，μg/L）绘制标准曲线。结果表明，在1、2、5、20、50、100 μg/L质量浓度范围内，各个化合物线性关系良好，线性方程和相关系数（r2）见表2。定量限采用在空白样品中逐级降低加标浓度的方法确定，得到氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈硫醚的定量限（RSN≥10）为0.5 μg/kg，氟虫腈砜、酰胺氟虫腈的定量限（RSN≥10）为1.0 μg/kg。

表2 线性方程和相关系数Table 2 Linear equations with correlation coef ficients

2.3.2 回收率与精密度

在不同动物源食品的空白样品中，分别进行2.0、10.0、20.0 μg/kg三个不同质量浓度水平的加标回收实验，每个水平重复测定6 次，结果见表3，回收率在80.2%～108.7%之间，相对标准偏差为3.8%～10.2%，说明该方法的准确度和精密度良好。代表性的空白鸡肉样品加标MRM色谱图见图3。

表3 加标回收率和相对标准偏差结果Table 3 Results of spiked recoveries and RSDs

图3 空白鸡肉样品加标（2..0 μg/kg）MRRMM色谱图Fig. 3 MRM chromatograms of spiked blank chicken meat samples(2.0 μg/kg)

2.4 实际样品检测结果

在农贸市场和超市购买不同的动物源食品，鸡蛋、鸡肉、鸡肝，每种样品各15 份，采用本方法进行检测，结果显示，有1 个鸡蛋样品中检出氟虫腈砜代谢药物残留，检出值为5.2 μg/kg（图4），没有超过GB 2763—2019限量要求。

图4 氟虫腈砜阳性鸡蛋样品的定量离子MRM色谱图Fig. 4 MRM chromatogram of a positive egg sample with fipronil sulfone

3 结 论

采用QuEChERS法提取和净化，建立动物源食品中氟虫腈及其4 种代谢产物（氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚、酰胺氟虫腈）残留量的GC-NCI-MS/MS测定方法。本研究在涵盖GB 2763—2019规定的禽蛋、禽肉、禽内脏中氟虫腈及氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚代谢物基础上，增加了酰胺氟虫腈的检测，通过选择NCI源和MRM模式，降低基体干扰，方法灵敏度高、准确性好，能够满足动物源食品中氟虫腈及其代谢产物残留量的确证和定量分析。