辣木籽油功能性成分检测及多元统计分析
2020-08-26王铁旦
王铁旦,杨 敏,杨 芳,杜 萍,*
(1.昆明理工大学分析测试研究中心,云南省分析测试中心,云南 昆明 652094;2.十堰市疾病预防控制中心,湖北 十堰 442000;3.武汉工程大学环境生态与生物工程学院,湖北 武汉 430205)
辣木是一种具有独特经济价值的热带植物,为辣木科(Moringaceae)辣木属(MoringaAdans.)多年生热带落叶乔木[1],又被称为杨椿树、鼓槌树或辣根树[2]。目前,种植最多的辣木品种是印度辣木(M. oleifera)和非洲辣木(M. stenopetala),其中又以印度辣木分布最广[3]。辣木素来就有“奇迹之树”的美誉[4-5],其叶、种子、树皮以及根等均是民间传统的药物,用于保健和治疗多种疾病。研究表明,辣木具有抗肿瘤[6]、降血糖[7]、免疫调节[8]、抑菌[9]、抗病毒[10]、抗辐射[11]等多种药理作用,被誉为新时代的健康食物。2012年,辣木已被批准为新资源食品,很多地区开始重视辣木的引种培育和开发利用,包括我国的云南、台湾、广东及广西[12]。
作为辣木加工副产物,辣木籽中油脂含量为25%~35%[13],目前,辣木籽油的提取工艺有压榨法[14]、微波辅助提取[15]、水酶法[16]、亚临界萃取[17]以及同时蒸馏萃取法[18]等。化学组成方面研究主要包括脂肪酸组成,作为构成油脂主要成分,脂肪酸的组成及配比很大程度上决定了植物油脂的营养价值和生物活性,是评价植物油的主要指标之一[19]。辣木籽中不饱和脂肪酸含量较高,其中油酸含量大于50%[20]。辣木籽油中还含有多种功能性成分,例如,生育酚和植物甾醇等可作为优质的食用油来源[13]。植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为主体骨架的活性物质,其中含量较多的有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇以及谷甾烷醇等,具有降血脂、降胆固醇、预防心血管疾病等作用,可用作食品抗氧化剂[21]。
我国云南省在20世纪初已从缅甸引种辣木[22],并进行辣木籽油系列产品的开发与精深加工[23],目前国内外对辣木的研究主要集中在辣木叶,而对辣木籽油中功能性成分的报道较少。为提高辣木综合加工的附加值,本实验从云南省8 个有代表性的产区的辣木籽中提取油脂,采用气相色谱-质谱联用技术研究其脂肪酸组成,采用高效液相色谱法测定其生育酚和甾醇的含量,并用主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚类分析(clustering analysis,CA)等多元统计方法对云南八产区的辣木籽油功能性成分进行差异分析,构建云南八产区辣木籽油功能性成分的综合指标评价模型,以期为辣木籽综合开发中原料的优选分级和功能因子评价提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
辣木籽样品采自云南省8 个辣木产区,编号为S1~S8,详细信息见表1,其品种均为印度辣木。样品经过挑选、烘干及粉碎后过40 目筛即得辣木籽粉,干燥密封待用。
生育酚系列标准品DL-α-生育酚(>96%)、(+)-δ-生育酚(>98%)、豆甾醇(纯度90%) 美国Sigma公司;其他试剂均为国产。
表1 辣木籽样品产地Table 1 Qeographical origins of M. oleiffeerraa seed samples used in this study
1.2 仪器与设备
S C I O N S Q 4 5 6-G C气相色谱-质谱联用仪美国B u r k e r公司;D B-W A X弹性石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm)、75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头 美国Supelco公司;KQ2200型超声波提取仪昆山市超声仪器有限公司;R-201D-II型旋转蒸发仪郑州长城科工贸有限公司;ACQuity Arc高效液相色谱仪、Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)美国沃特世公司。
1.3 方法
1.3.1 辣木籽油的提取
参考王 美霞等[24]的方法提取油脂,略有改动。分别称取辣木籽粉样品17.0 g于三角烧瓶中,加入100 mL沸程30~60 ℃的石油醚,浸泡过夜,离心,滤渣用30 mL的石油醚分3 次洗涤,合并滤液及洗涤液于圆底烧瓶,经旋转蒸发浓缩、干燥制得辣木籽油。将含有辣木籽油的浸提烧杯于80 ℃烘干至恒质量,冷却称质量,并按下式计算含油量:
式中:A0为辣木仁样品质量/mg;A1为浸提烧杯质量/mg;A2含有辣木籽油的浸提烧杯质量/mg。
1.3.2 辣木籽油脂肪酸组成分析
甲酯化条件:称取油样0.2 g于20 mL具塞试管中,加入4 mL 0.4 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液,摇匀。于60 ℃水浴中加热至油珠完全溶解(约30 min),冷却后加入2.0 mL的25%三氟化硼-甲醇溶液,于60 ℃水浴酯化20 min,冷却至室温后加入2.0 mL正己烷,摇匀;再加入2 mL饱和氯化钠溶液摇匀,10 000 r/min离心5 min,取上层溶液进行GC-MS分析。
气相色谱条件:DB-WAX弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升温:170 ℃,保持1 min,以4 ℃/min升温至260 ℃,保持10 min。进样方式为分流进样,分流比10∶1,进样量0.2 μL;进样口温度260 ℃,检测器温度280 ℃,载气为高纯氦气,流速1.7 mL/min。
质谱条件:电子电离源;电子能量70 eV;离子源温度200 ℃。监测方式为全扫描;质量扫描范围m/z25~450;溶剂延迟时间4 min。
定性方法:将样品色谱图中的每个峰与Wiley和NIST谱库中进行比对,仅选取相似度指数大于800的物质,同时通过比对文献化合物中的相对保留指数对所得化合物定性结果进行验证。
1.3.3 辣木籽油生育酚含量测定
皂化前处理[25]:准确称取1.0 g油样于10 mL皂化管中,依次加入0.1 g VC、3 mL氢氧化钾-95%乙醇(2 mol/L)溶液,涡旋30 s后,在90 ℃恒温振荡器(220 r/min)中振荡反应60 min,皂化后冷却,加入5 mL正己烷,涡旋5 min后,5 000 r/min离心10 min,取上清液,重复2 次。将上清液旋蒸干燥至1 nL左右,用甲醇定容至10 mL。过0.45 μm滤膜,进行高效液相色谱分析。
标准品的配制:分别称取10 mg的α-生育酚和δ-生育酚标准品,溶于100 mL乙醇中,过0.45 μm滤膜,进行高效液相色谱分析。
高效液相色谱条件:Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇,流速1. 0 mL/min,等度洗脱,柱温30 ℃。α-生育酚和δ-生育酚的检测 波长均为292 nm[25]。
1.3.4 辣木籽油甾醇含量测定
取1.3.3节中皂化后的样品,过0.45 μm微孔滤膜后,进行高效液相色谱测定[25]。
标准品的配制:分别称取10 mg豆甾醇的标准品,溶于100 mL乙醇中,过0.45 μm滤膜,进行高效液相色谱分析。
高效液相色谱条件:SymmetryC18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇,流速为1.0 mL/min,等度洗脱,柱温30 ℃。豆甾醇的检测波长为205 nm,进样量10 μL。
1.4 数据处理
所有数据均为3 组平行实验数据取平均值;采用IBM SPSS Statistics 25(IBM, Armonk, NY, USA)软件进行PCA、CA以及显著性分析,采用Tukey's HSD法进行多重比较分析。
2 结果与分析
2.1 辣木籽含油量分析
如表2所示,云南八产地辣木籽样品的含油量在19.50%~26.34%之间,平均含油量为23.10%。含油量最高的是临沧市耿马县辣木样品S6(23.95%),含油量低的是丽江市华坪县辣木样品S5(21.95%),但总体上看,八产地的辣木籽样品的含油量无显著差异(P>0.05)。
表2 不同产地辣木籽的含油量Table 2 Oil yields of M. oleifera seeds from different areas
2.2 辣木籽油脂肪酸组成的气相色谱-质谱检测结果
图1 辣木籽油(S8)脂肪酸样品的典型总离子流图Fig. 1 Typical total ion current chromatograms of fatty acids of M. oleifera seed oil (S8) from Shuangbai county, Yunnan
表3 云南八产地辣木籽油脂肪酸组成的气相色谱-质谱分析Table 3 GC-MS analysis results of fatty acid components of M. oleifera seed oils from eight areas of Yunnan
由图1、表3可知,从云南八产地辣木籽油中均检测出20 种脂肪酸,其组成基本一致,其脂肪酸含量前十位分别为9-十八碳烯酸(油酸)、二十二烷酸(山嵛酸)、十六烷酸(棕榈酸)、十八烷酸(硬脂酸)、二十烷酸(花生酸)、(E)-11-二十烯酸、7-十六碳烯酸、二十四烷酸(木焦油酸)、13-二十二碳烯酸(芥酸)以及十七烷酸,可以认为这10 种成分是辣木籽油脂肪酸的主要特征成分。本研究中选用的云南八产地辣木籽油样品中,不饱和脂肪酸含量平均占65.39%,其中,油酸含量最高(50.16%~56.51%),略低于云南省红河州的辣木籽油样品(71.90%)[19]。
2.3 辣木籽油生育酚和甾醇含量测定结果
表4 云南八产地辣木籽油VE和甾醇含量Table 4 Contents of tocopherol and sterol of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan
作为一种公认的天然抗氧化剂,生育酚具有抑制胆固醇合成及肿瘤细胞生长、改善动脉粥样硬化及预防心血管疾病等生理功效。在化学结构上均系苯二氢吡喃的衍生物,根据甲基位置及数量的不同分为α、β、γ和δ几种。本实验中选取α-生育酚和δ-生育酚为代表,研究辣木籽油生育酚的组成,其中α-生育酚的生理活性最强,植物油中生育酚的存在对油脂的氧化稳定性亦具有重要意义。由表4可以看出,辣木籽油中α-生育酚含量为45~80 mg/100 g,平均含量为62 mg/100 g,高于吕秋冰等[26]报道的超声波辅助提取所得辣木籽油的α-生育酚(0.945 mg/100 g)。辣木籽油中δ-生育酚含量为0.21~0.53 mg/100 g,平均含量为0.40 mg/100 g。
甾醇在降低血清胆固醇、抗菌及消炎等方面具有显著疗效,本实验中以豆甾醇为代表,研究辣木籽油样品中的甾醇含量。实验结果显示,辣木籽油中豆甾醇含量为243~495 mg/100 g,平均含量为369 mg/100 g。豆甾醇含量最高的辣木籽油产地为S3(西双版纳州景洪市),含量为495 mg/100 g,高于葡萄籽中的豆甾醇含量(15 mg/100 g)[27]。
2.4 不同产地辣木籽油的多元统计分析
2.4.1 不同产地辣木籽油的PCA
采用IBM SPSS Statistics 25软件对云南八产区辣木籽油样品含量前十的脂肪酸含量、α-生育酚、δ-生育酚以及豆甾醇进行PCA,结果显示前4 个主成分的累计方差贡献率为93.234%(表5),说明前4 个主成分基本包含了辣木籽油脂肪酸组成的绝大部分信息,可用于综合品质评价与分类。在前4 个主成分中,PC1的贡献率为28.550%,贡献最大的为十八烷酸(硬脂酸),对应的特征值为0.371。PC2的贡献率为28.452%,贡献最大的为9-十八碳烯酸(油酸)和豆甾醇,对应的特征值为0.392和0.198。PC3的贡献率为19.214%,贡献最大的为(E)-11-二十烯酸(花生油酸),对应的特征值为-0.468。PC4的贡献率为17.018%,贡献最大的为十七烷酸,对应的特征值为0.415。
表5 PCA特征向量、特征值、方差贡献率及累计方差贡献率Table 5 Eigenvectors, eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates to total variance of principal components
图2 云南八产地辣木籽油样品的PCA评分图Fig. 2 PCA Score plot of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan
PCA可以有效区分不同产地辣木籽油样品的脂肪酸组成、生育酚及豆甾醇的含量,如图2所示,在PC1方向上,8 个样品明显分为3 个部分,分别为S3、S8以及余下的6 个样品,3 组样品在PC2方向也表现出了极大的成分差异性。以4 个主成分F1、F2、F3和F4与其方差贡献率构建辣木籽油品质指标综合得分模型F总,F总为因变量,F1、F2、F3和F4为自变量,F总为F1、F2、F3和F4的线性组合:
F总=28.550%F1+28.452%F2+19.214%F3+17.018%F4
各产地辣木籽油在各个主成分的得分值见表6,分值越高代表品质越好。结果显示,各产地辣木籽油品质评价模型得分具有一定差异性,表明不同产地辣木籽油在脂肪酸组成、生育酚及豆甾醇的含量上存在产地差异性,根据得分和排序,西双版纳州景洪市的S3样品综合得分为1.232,高于其他样品的得分。该样品具有最高的油酸相对含量(56.51%)、不饱和脂肪酸总相对含量(70.11%)、α-生育酚含量(80 mg/100 g)、δ-生育酚含量(0.53 mg/100 g)以及豆甾醇含量(495 mg/100 g),具有最优的综合品质。
表6 云南八产地辣木籽油样品质量评价Table 6 Quality evaluation of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan
2.4.2 不同产地辣木籽油的CA
图3 云南八产地辣木籽油样品的CA树状图Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan
采用IBM SPSS Statistics 25软件对辣木籽油脂肪酸数据进行系统CA,以平方欧式距离为度量标准,通过组间连接的方式,对云南八产地辣木籽油的脂肪酸组成进行CA。由图3可知,当距离刻度为1~25时,云南八产地辣木籽样品可分为3 个集群,第1个集群是S3单独为1 个集群,该样品综合得分为1.232,综合PCA得分排名第1;其余7 个样品(S1、S5、S4、S6、S8、S2以及S7)为第2个集群,综合得分在-0.624~0.215之间,综合品质低于S3。由此可见,CA可以根据刻度不同获得多种分类结果,其在刻度为1~25时的分类结果同PCA分析一致,说明2 种分析方法均可对八产地辣木籽样品进行分类,并通过分类进行综合品质评价,为今后辣木籽油的生产加工中的品种筛选提供理论依据。
3 讨论与结论
作为辣木加工副产物,辣木籽富含多种功能性成分,在食品、药用及轻工等方面具有很大的应用价值。本实验以云南八产地辣木籽油为原料,分析辣木籽油中脂肪酸、α-生育酚、δ-生育酚及豆甾醇这几类脂溶性活性成分的含量,实验结果显示,云南八产地辣木籽油均含有20 种脂肪酸,不饱和脂肪酸相对含量平均为65.39%,其中9-十八碳烯酸(油酸)的相对含量均大于50%。辣木籽油中α-生育酚(45~80 mg/100 g)、δ-生育酚(0.21~0.53 mg/100 g)、豆甾醇(243~495 mg/100 g)具有开发功能性大健康产品的潜力。生育酚和豆甾醇的含量差异显著,可能与不同产地的地理环境、气候条件等因素有关。通过PCA,根据特征向量构建主成分与各产地辣木籽油品质指标之间的线性函数,构建了辣木籽油综合品质评价模型,得到不同样品综合品质得分从高到低为S3、S1、S5、S4、S6、S8、S2、S7。其中,西双版纳州景 洪市S3样品的品质明显高于其他产地样品,表明综合指标评价系统能用于辣木籽油品质评价。通过CA,云南八产地辣木籽油可分成2 个集群,综合评分最高的S3为一个集群,其余7 个样品为第2个集群,结果与PCA一致。因此,PCA和CA能较好反映辣木籽油样品间的差异性,本研究可为辣木籽精深加工提供一定的参考依据。